为确定有无支原体污染可做如下检测：

1.相差显微境检测

将细胞按种于事先放置于培养瓶内的盖玻片上，24h后取出，用相差油镜观察，支原体呈暗色微小颗粒位于细胞表面和细胞之间。

2.荧光染色法

荧光染色用能与DNA特异性结合的荧光染料Hoechst 33258，可使支原体内含有的DNA着色，染色后用荧光显微镜观察。具体方法如下：首先将细胞接种盖玻片上，在细胞未长满前取出玻片，用不合酚红的 Hanks液漂洗一下，用l： 3醋酸甲酵固定10Min，然后用生理盐水漂洗，置于用生理盐水配浓度为50pg／ml的Hoechst 33258中染色10min。染色后用蒸溜水洗1-2min，向细胞面滴加pH5．5磷酸缓冲液数滴，然后置荧光显微镜下观察。镜下支原体为散在于细胞同围或附于细胞膜表面的亮绿色小点。

3.电镜检查

用扫描电镜方法简便快速，也可以利用透射电镜。

4.DNA分子条文检查或支原体培养等方法

检出率高，但方法较为复杂。

支原体是一类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物，大小一般在0.3-0.5μm之间，呈高度多形性，有球形、杆形、丝状、分枝状等多种形态。它不同于细胞，也不同于病毒。支原体用普通染色法不易着色，用姬姆萨染色很浅，革兰染色为阴性。支原体可在鸡胚绒毛尿囊膜上或细胞培养中生长，营养要求比细菌高。

支原体污染的来源包括工作环境的污染、操作者本身的污染（一些支原体在人体是正常菌群）、培养的污染、污染支原体的细胞造成的交叉污染、实验器材带来的污染和用来制备细胞的原始组织或器官的污染。细胞培养工作中，主要从以下几个方面来预防支原体的污染：控制环境污染；严格实验操作；细胞培养和器材要保证无菌；在细胞培养中加入适量的抗生素。

1、支原体检测

荧光定量PCR法（qPCR）：是在常规PCR基础上，将『针对支原体特异性保守序列的探针』做荧光标记，使PCR扩增后的产物带有荧光，利用荧光信号的变化和配套软件，进行DNA扩增反应的实时监测，简称qPCR。

优点：①灵敏度高、特异性强。

②时间短，2-3小时出结果。

③检测结果可定量。

④操作简便。

缺点：①对于已做支原体灭活处理的样品，由于支原体DNA仍旧存在其中，PCR结果会出现假阳性。（可用培养法做补充验证）

②不同厂家生产的试剂盒质量差异巨大（由于引物及内在设计不同），需谨慎选择，尽量在专业人员推荐指导下使用。

德国MB公司生产的支原体qPCR检测试剂盒（均为探针法检测），依据操作步骤的细微差别，

分『经典法』和『一步法』两种。

2、环境空间消毒方案

试验台、超净台、培养箱、液氮罐、移液器、门把手、电话等细胞培养环境

被支原体污染，可引起细胞的污染。应定期对工作区域进行消毒。

德国MB生产的Mycoplasma-offTM喷雾剂，或湿巾擦拭 5-10分钟清除，对支原体、细菌、真菌、霉菌、孢子祛除确切有 效。无残留, 无腐蚀, 无致癌性，操作简单方便。

qPCR法介绍：

荧光定量PCR法（qPCR）：是在常规PCR基础上，将『针对支原体特异性保守序列的探针』做荧光标记，使PCR扩增后的产物带有荧光，利用荧光信号的变化和配套软件，进行DNA扩增反应的实时监测，简称qPCR。

优点：①灵敏度高、特异性强。

②时间短，2-3小时出结果。

③检测结果可定量。

④操作简便。

缺点：①对于已做支原体灭活处理的样品，由于支原体DNA仍旧存在其中，PCR结果会出现假阳性。（可用培养法做补充验证）

②不同厂家生产的试剂盒质量差异巨大（由于引物及内在设计不同），需谨慎选择，尽量在专业人员推荐指导下使用。

原创作者：北京缔一生物科技有限公司