qPCR Kit  (经典法)

Venor®Gem qEP

 支原体qPCR法介绍：

荧光定量PCR法（qPCR）：是在常规PCR基础上，将『针对支原体特异性保守序列的探针』做荧光标记，使PCR扩增后的产物带有荧光，利用荧光信号的变化和配套软件，进行DNA扩增反应的实时监测，简称qPCR。

优点：①灵敏度高、特异性强。

          ②时间短，2-3小时出结果。

          ③检测结果可定量。

          ④操作简便。

缺点：①对于已做支原体灭活处理的样品，由于支原体DNA仍旧存在其中，PCR结果会出现假阳性。（可用培养法做补充验证）

          ②不同厂家生产的试剂盒质量差异巨大（由于引物及内在设计不同），需谨慎选择，尽量在业人员推荐指导下使用。

『支原体qPCR检测试剂盒』介绍

德国MB公司生产的支原体qPCR检测试剂盒（均为探针法检测），依据操作步骤的细微差别，

分『经典法』和『步法』两种。    

此两类试剂盒较全球其他厂家同类产品，具有以下独特的优点：

①经典法qPCR试剂盒遵循欧洲药典流程要求

②高特异性，次检测即可涵盖了所有可能感染细胞的支原体物种（涵盖欧洲药典规定的9种支原体），根据序列致性，至少可以检测到107种支原体物种。操作简单，易于观察。

（使用MB的试剂盒，下表中列出的支原体物种均为阳性，其他微生物或真核细胞均为阴性，无交叉反应）

③高灵敏度，MB公司的经典法试剂盒低检测限可达到≤10CFU/ml。

MB公司的步法qPCR试剂盒低检测限≥50个基因组/反应。

④MB公司有相应配套的10CFU/100CFU的敏感度测试的标准品，便于方法学验证。

⑤MB公司有相应配套的支原体基因组DNA和细菌基因组DNA，便于特异性验证。

⑥MB公司有相应配套的支原体绝对定量标准品，便于后定量检测。

特点

1. 内控对照为独立包装，遵循欧洲药典和日本药典操作流程。

2. 高特异性，次检测即可涵盖所有常见易感染细胞的支原体物种（包括欧洲药典规定的9种支原体）。与细菌和真核DNA无交叉反应。

3. 高灵敏度，低检测限可达到≤10CFU/ml。 

4. 有相应配套的支原体基因组DNA和细菌基因组DNA，便于特异性验证。

5.有相应配套的支原体绝对定量标准品，便于后定量检测。

操作步骤

第1步：样本处理

a.细胞培养上清

b. 生物药或需遵循药典的样本 

说明：①样品基质可能会影响检测的灵敏度。收集和筛选更高的样品量可提高测定灵敏度。

          ②细胞培养物样本含丰富的DNA酶，在低温下也能降解支原DNA，影响检测灵敏度。

          建议：样本做DNA抽提处理，实现高灵敏度。

          推荐：德国MB公司生产的用支原体DNA提取试剂盒

          Venor® Gem Sample Preparation Kit

          该DNA抽提试剂盒已经过广泛验证。

第2步：试剂制备

a. 冻干粉溶解

b. 反应体系制备

b1) 样品为细胞上清筛查——反应体系制备

b2) 样品为生物药——反应体系制备

第3步：启动荧光定量PCR仪

第4步：结果判别

FAM通道：检测支原体荧光信号。HEX通道：检测内控对照荧光信号。

支原体DNA和内控DNA存在信号的竞争性抑制。

支原体DNA越多，FAM通道信号越高，检测内控对照的HEX通道信号越低。

定量需基于Ct值和DNA标准曲线。

Ct＜40为阳性结果。Ct≥40为阴性结果。

示意图：

储存条件

2~8℃保存至少12个月。复溶后-18℃以下保存。