ELISA实验中常见问题及原因分析

（一）   ELSIA实验中结果颜色浅、灵敏度偏低的原因

1.       试剂盒在运输、保存期间放置的温度过高，时间过长，造成抗原、抗体效价下降，酶的活力降低。

2.       试剂盒已经超出保存的有效期，抗原抗体效价下降，酶的活性降低。

3.       移液取样不足，移液时抽吸、排放太快，移液嘴内壁挂液太多或者内壁不清洁。造成加样量不足。

4.       孵育温度偏低，或多块反应板重叠放置造成孔内的实际温度偏低，使抗原、抗体复合物形成过少。

5.       保温时间不足，抗原、抗体反应不完全。

6.       显色剂加入量不足。

7.       显色液A,B比例不对。

8.       洗涤时冲击力过大，洗涤液浸泡时间太长，洗涤次数增加，导致已经形成的抗原、抗体复合物洗脱。

9.       底物反应的温度不够、时间不足。

（二）   ELSIA实验中结果出现白板、阳性对照不显示的原因

1.       洗涤液配制有误。

2.       终止液误作为浓缩洗涤液或者酶结合物稀释使用。

3.       漏加酶结合物，误加酶结合物或者酶标二抗的实验顺序错误。

4.       终止液当作缓冲溶液使用。

5.       配制溶液中残留了灭活酶活力的物质。

6.       底物液未加入OPD或者TMB.

7.       运输、存储不当、导致酶活力丧失。

8.       底物液中未加入过氧化氢或放置过久过氧化氢失效。

（三）   ELSIA实验中结果全部显色的原因

1.       酶结合物的浓度过大。

2.       孵育温度偏高，底物显色时间过长。

3.       洗涤不充分，样品有其他成分残留或者酶结合物残留。

4.       底物配制时间过久，底物受光照射时间较长或污染。

5.       整批样品放置时间过长被污染或生长细菌。

6.       移液嘴重复使用时，未清洗干净或者消毒不彻底。

7.       配制溶液的水质有问题。

（四）   ELSIA实验中结果阴性、阳性对照显色差距较小的原因

1.       稀释不准、加样量不准。

2.       加样时各孔均被污染。

3.       底物不新鲜，配制时间过长或被污染。

4.       试剂效价下降或超过了试剂的有效使用期。

5.       配制溶液的水质有问题。

（五）   ELSIA实验结果重复性不好的原因

1.       样品加入量多少不一，加样时间又长有短。

2.       样品加入后未充分混合均匀。

3.       移液加样器加样量不一致。

4.       酶标仪滤光片不对。

5.       操作过程中个别反应孔中液体外溅。

6.       不同批号试剂混用。

7.       瓶盖交叉使用。

8.       孵育条件和保温时间不一致。

9.       显色时间和条件不一致

10.   边缘效益，导致周边孔（尤其是四个角）较中央孔显色深。

11.   将酶结合物或底物溶液加在孔壁上，并有残留。

12.   酶结合物未充分混匀就加入反应孔中。

13.   洗涤条件不一致。

14.   多加或少加了酶标记物、底物。

原创作者：上海仁捷生物科技有限公司