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ELISA试剂盒常见问题解决方案
点击次数：2549 发布时间：2017/7/5
ELISA 实验因其灵敏度较高、特异性较好而广泛应用于临床上，但操作中的各环节对检测效果影响较大，稍不注意，就有可能导致显色不全、花板。
问题主要集中在这几个方面：选材、加样、孵育、洗板、显色、终止、读板。问题及解决方案具体解析如下：
选材
选择质量优良的检测试剂（可以看下 ELISA 试剂盒选购经验总结篇），操作前将试剂在室温下平衡 30-60 分钟。
加样
出现问题可能原因
1. 血清或血浆标本分离不好即进行加样。
2. 手工操作中，加样板过多造成加样后放入孵箱前等待时间过长（特别是室内温度较高时）。
3. 加完标本再加酶试剂时酶溅出孔外。
解决方案
1. 标本为血清：将血液先自然存放 1-2 小时后，再用 3000 rmp 离心 15 分钟；标本为血浆：必须使用含抗凝剂的血液标本收集管，采血后必须立即颠倒采血管混合 5-10 次，放置一段时间后，3000 rpm 离心 15 分钟；若在几天内检测，可放在 2-8℃冰箱中，若要贮存，则置于 -20℃的低温冰箱内。
2. 加样后及时放入孵箱。
3. 加酶试剂后用吸水纸在酶标板表面轻拭吸干。
4. 如果采用 AT 或其他全自动加样，选择 FAME 或其他后处理仪器加酶试剂。
5. 标本较多时，请分批操作。
孵育
出现问题可能原因
1. 孵育时未贴封片或加盖，使标本或稀释液蒸发，吸附于孔壁，难于清洗彻底。
2. 孵育时间人为延长，导致非特异性结合紧附于反应孔周围，难以清洗彻底。
解决方案
1. 贴封片或加盖；
2. 按说明步骤严格控制操作时间。
洗板
出现问题可能原因
1. 采用手工洗板，孔与孔之间液体交叉。
2. 采用半自动洗板机洗板时，洗液量不足，导致洗板不彻底；洗板针堵塞，抽吸不完全；洗板不畅，导致洗板效果差。
3. 反应板过多造成洗板等待时间长。
解决方案
1. 保证洗液注满各孔，洗板针畅通，洗完板后在吸水纸（选择干净、无或少尘的吸水材料）上轻轻拍干。
2. 合理安排，或多用几台洗板机。
显色
出现问题可能原因
1. 显色剂配制后放置时间过长或使用过期显色剂。
2. 加显色剂时溅出孔外造成液体回流。
解决方案
1. 显色剂尽量在临用前配制，坚持不用过期显色剂，肉眼可见浅蓝色的 TMB 显色剂不用。
2. 加样时保持显色剂不外流。
3. A、B 液应避免接触金属器械。
终止
出现问题可能原因
加终止液时产生较多气泡，导致假阳性增加。
解决方案
加终止液时应避免产生气泡。
读板
出现问题可能原因
读板时板底不清洁。
解决方案
应保证酶标板清洁。
全过程
1. 整个操作过程中保证酶标板不接触次氯酸。
2. 实现 ELISA 检测标准自动化，有效提高检测质量。
问题主要集中在这几个方面：选材、加样、孵育、洗板、显色、终止、读板。问题及解决方案具体解析如下：
选材
选择质量优良的检测试剂（可以看下 ELISA 试剂盒选购经验总结篇），操作前将试剂在室温下平衡 30-60 分钟。
加样
出现问题可能原因
1. 血清或血浆标本分离不好即进行加样。
2. 手工操作中，加样板过多造成加样后放入孵箱前等待时间过长（特别是室内温度较高时）。
3. 加完标本再加酶试剂时酶溅出孔外。
解决方案
1. 标本为血清：将血液先自然存放 1-2 小时后，再用 3000 rmp 离心 15 分钟；标本为血浆：必须使用含抗凝剂的血液标本收集管，采血后必须立即颠倒采血管混合 5-10 次，放置一段时间后，3000 rpm 离心 15 分钟；若在几天内检测，可放在 2-8℃冰箱中，若要贮存，则置于 -20℃的低温冰箱内。
2. 加样后及时放入孵箱。
3. 加酶试剂后用吸水纸在酶标板表面轻拭吸干。
4. 如果采用 AT 或其他全自动加样，选择 FAME 或其他后处理仪器加酶试剂。
5. 标本较多时，请分批操作。
孵育
出现问题可能原因
1. 孵育时未贴封片或加盖，使标本或稀释液蒸发，吸附于孔壁，难于清洗彻底。
2. 孵育时间人为延长，导致非特异性结合紧附于反应孔周围，难以清洗彻底。
解决方案
1. 贴封片或加盖；
2. 按说明步骤严格控制操作时间。
洗板
出现问题可能原因
1. 采用手工洗板，孔与孔之间液体交叉。
2. 采用半自动洗板机洗板时，洗液量不足，导致洗板不彻底；洗板针堵塞，抽吸不完全；洗板不畅，导致洗板效果差。
3. 反应板过多造成洗板等待时间长。
解决方案
1. 保证洗液注满各孔，洗板针畅通，洗完板后在吸水纸（选择干净、无或少尘的吸水材料）上轻轻拍干。
2. 合理安排，或多用几台洗板机。
显色
出现问题可能原因
1. 显色剂配制后放置时间过长或使用过期显色剂。
2. 加显色剂时溅出孔外造成液体回流。
解决方案
1. 显色剂尽量在临用前配制，坚持不用过期显色剂，肉眼可见浅蓝色的 TMB 显色剂不用。
2. 加样时保持显色剂不外流。
3. A、B 液应避免接触金属器械。
终止
出现问题可能原因
加终止液时产生较多气泡，导致假阳性增加。
解决方案
加终止液时应避免产生气泡。
读板
出现问题可能原因
读板时板底不清洁。
解决方案
应保证酶标板清洁。
全过程
1. 整个操作过程中保证酶标板不接触次氯酸。
2. 实现 ELISA 检测标准自动化，有效提高检测质量。
