通用名称：雌二醇（E2）定量检测试剂盒（ELISA）

英文名称：Estradiol ELISA KIT

【包装规格】

96T/48T

【预期用途】

仅供科研使用，定量检测血清、血浆、细胞培养上清液中雌二醇（E2）的浓度。

【检验原理】

本试剂盒采用竞争法酶联免疫吸附试验（ELISA）。在预包被抗雌二醇（E2）抗体（固相抗体）的微孔酶标板中，加入 雌二醇（E2）校准品和待测样本，再加入HRP标记的 雌二醇（E2）抗原（酶标抗原），经过温育与充分洗涤，去除未结合的组分，在微孔板固相表面形成固相抗体-酶标抗原的免疫复合物。加底物A和B，底物在HRP催化下，产生蓝色产物，在终止液（2M 硫酸）作用下，*终转化为黄色，在酶标仪450nm波长上测定吸光度（OD值），吸光度（OD值）与待测样品中 雌二醇（E2）的浓度负相关。拟合校准品曲线，可以计算出样本中 雌二醇（E2）的浓度。

【主要组成成分】

主要成分

标准品浓度依次为：500、250、125、62.5、31.25、0 pg/mL

本品必须按照具有潜在的感染性进行处理，处理过程应当遵循通用的安全措施。

需要但未提供的材料及耗材

  1、酶标仪

2、精密移液器及一次性吸头

3、蒸馏水

4、洗瓶或者自动洗板机

5、37℃水浴锅或恒温箱

6、500ml量筒

7、无粉一次性乳胶手套

【适用仪器】

  半自动的酶标仪，如Thermo MK3，或者国产酶标仪。

【样本要求】

  样本类型和采集

以下只是列出样品采集的一般指南。所有样本采集过程中，不得使用叠氮钠做为防腐剂。

1、细胞培养上清：4000rpm条件下离心20min，去除细胞颗粒和聚合物，上清液保存在- 20℃以下，避免反复冻融。

2、血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，4000rpm条件下离心20min，小心地分离出血清，保存在- 20℃以下，避免反复冻融。

3、血浆：肝素，EDTA，或柠檬酸钠作为抗凝剂。在4000rpm条件下，离心20分钟取上清，血浆保存在-20℃以下，避免反复冻融。

4、组织匀浆：用预冷的PBS (0.01 M,pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液，称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS(一般按1: 9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9 mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂)加入玻璃匀浆器中，在冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎或反复冻融。将匀浆液5000×g离心 5-10分钟，取上清检测。

样本保存和稳定性

样本在2-8℃条件下，可以储存72h，或者在- 20℃储存6个月。样本收集后，不是一次检测完，请按一次用量分装冻存，避免反复冻融，使用时在室温下解冻，确保样品均匀充分解冻。

【检验方法】

试剂准备

1、使用前，所有的组分都要至少复温30min，确保充分复温到室温。

2、浓缩洗涤液：从冰箱取出的浓缩洗涤液，会有结晶产生，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解。浓缩洗涤液与蒸馏水，按1:20稀释，即1份的浓缩洗涤液，添加19份的蒸馏水。

操作程序

1. 按前面说明书描述的方法，配制好试剂盒各种组分的工作液。

2. 从铝箔袋中取出所需板条，剩余的板条用自封袋密封放回冰箱。设置标准品孔、空白孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL，空白孔不加，样本孔加待测样本50μL。

3. 除空白孔外，标准品孔和样本孔，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗原100μL。

4. 用封板膜盖住反应板，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5. 揭开封板膜，弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置20S，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复5次。若使用自动洗板机，请按洗板机操作程序进行洗板，添加浸泡30s的程序，可以提高检测的精度。洗板结束，加底物前，要在干净不掉屑的纸上，充分拍干反应板。

6. 将底物A和B按1:1体积充分混合，所有孔中加入底物混合液100μL。用封板膜盖住反应板，37℃水浴锅或恒温箱温育15min。

7. 所有孔加入终止液50μL，在450波长的酶标仪上读取各孔吸光度（OD值）。

【实验结果计算】

检测完成后，以标准品浓度做为纵坐标，对应的吸光度（OD值）作为横坐标，利用计算机软件，采用四参数Logistic曲线拟合（4-pl），创建标准曲线方程，通过样本的吸光度（OD值），利用方程计算样品的浓度值。

如果样品被稀释，通过上述方法测的的浓度值，要乘以稀释倍数，才是样品的*终浓度。

【检验方法的局限性】

1、仅供科研使用，不得用于临床诊断。

2、在试剂盒标示的期内使用，过期产品不得使用。

3、跟其他厂家的试剂盒或者组分不能混用。

4、使用试剂盒配套的样品稀释液。

5、如果样本值高于标准品浓度值，请将样本适当稀释后，再重新测定。

6、通过其他方法得到的检测结果，与本试剂盒测定结果不具有直接的可比性。

【产品性能指标】

1. 外观和物理检查:试剂盒应组分齐全，内外包装均应完整，标签清晰，液体试剂无渗漏。各组分装量不少于表1中要求。

2. 线性:用四参数Logistic曲线拟合（4-pl），在31.25 pg/mL– 500 pg/mL范围内，剂量-反应曲线相关系数（r）的绝对值应不低于0.9900。

3. 精密度

3.1分析内精密度:试剂盒质控品测定结果的变异系数（CV）应不大于15.0%。

3.2批间精密度:在三个不同批次产品之间，质控品测定结果的变异系数（CV）应不大于15.0%

4. 检出限:检测浓度小于1.0 pg/mL。

质控品测定值: 每次检测结果均应在允许范围内。

原创作者：上海仁捷生物科技有限公司