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纯化线粒体冻存液（生物能量学保护）（化学处理法）

实验开始前，将－20℃冰箱里的净化液（Reagent C）取出冻融，然后移出xx毫升净化液（Reagent C）和xx毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升锥形离心管里，混匀后，标记为裂解工作液，放进冰槽里备用。然后进行下列操作。

1． 准备5至10瓶75cm²细胞培养瓶的细胞（5 X 10⁷），直至细胞生长铺满整个培养表面

2． 分别加入10毫升用户自备的HANK平衡盐缓冲溶液或PBS缓冲溶液到每个细胞培养瓶，覆盖培养瓶表面，然后抽去

3． 重复实验步骤2一次

4． 加入3毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满整个细胞生长表面

5． 置入37℃培养箱3分种

6． 轻轻手击震动培养瓶，使细胞脱落

7． 分别加入10毫升用户自备的完全细胞培养液

8． 移入一个50毫升锥形离心管

9． 放进台式离心机离心10分钟，速度为200g

10． 小心抽去上清液

11． 加入xx毫升预冷的清理液（Reagent A）

12． 放进台式离心机离心10分钟，速度为300g

13． 小心抽去上清液

14． 加入xx毫升预冷的裂解工作液

15． 涡旋震荡5秒，充分混匀

16． 在冰槽里孵育2分钟，期间涡旋震荡5秒一次

17． 加入xx微升预冷的强化液（Reagent D）

18． 涡旋震荡5秒，充分混匀

19． 在冰槽里孵育5分钟，期间涡旋震荡5秒二次（注意：参见注意事项9）

20． 加入xx毫升预冷的保存液（Reagent E），轻轻摇动试管混匀

21． 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g

22． 小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞

23． 放进4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g

24． 小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物

纯化线粒体冻存液（生物能量学保护）注意：如果进行线粒体DNA萃取，直接进入线粒体DNA萃取试剂盒的步骤4，继续下去

25． （选择步骤）加入xx毫升预冷的保存液（Reagent E）

26． （选择步骤）放进4℃超速离心机再次离心5分钟，速度为10000g

27． （选择步骤）小心抽去上清液

28． 加入xx毫升保存液（Reagent E），充分混匀

29． 即刻移入1.5毫升离心管，放进－70℃冰箱里

纯化线粒体冻存液（生物能量学保护）保存方式

保存净化液（Reagent C）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保证6月

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