链霉素检测试剂盒使用说明书（酶联免疫法）

 1 原理及用途

本试剂盒采用间接竞争ELISA方法检测组织、蜂蜜等样本中的链霉素（Streptomycin，SM），试剂盒由预包被偶联抗原的酶标板、酶标记物、抗体、标准品及其他配套试剂组成。检测时，加入标准品或样本溶液，样本中的链霉素和酶标板上预包被偶联抗原竞争抗链霉素抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样本吸光度值与其所含链霉素含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中链霉素的残留量。

2 技术指标

2.1试剂盒灵敏度：0.1ppb(ng/ml)

2.2 反应模式：25℃，30min～30min～15min

2.3 检测下限：

组织………………………………4ppb

蜂蜜………………………………2ppb

牛奶、奶粉………………………5ppb

禽蛋………………………………10ppb

2.4 交叉反应率：

链霉素……………………………100%

双氢链霉素………………………100%

卡拉霉素…………………………6.3%

庆大霉素…………………………2.5%

 2.5 样本回收率：

组织、蜂蜜、牛奶、禽蛋………85±15%

3 试剂盒组成

酶标板……………………………96孔

标准品：各1ml

0ppb、0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb

高标准品（红盖）：1ppm…………1ml

酶标记物（红盖）……………………11ml

抗体工作液（蓝盖）…………………5.5ml

底物液A（白盖）……………………6ml

底物液B（黑盖）……………………6ml

终止液（黄盖）………………………6ml

20X浓缩洗涤液（白盖）……………40ml

5X复溶液（黄盖） …………………50ml

说明书…………………………………1份

盖板膜…………………………………1张

自封袋…………………………………1个

4 需要的器材和试剂

4.1 仪器：酶标仪、打印机、均质器 、氮气吹干装置、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量0.01g）

4.2 微量移液器：单道20?l-200?l，100?l-1000?l、多道300?l

4.3 试剂：NaOH、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、正己烷、磷酸、冰醋酸、甲醇

5 样本前处理

5.1 样本处理前须知：

实验器具必须洁净并使用一次性吸头，以避免污染干扰实验结果。

5.2 配液：

配液1：0.05M  PB缓冲液

    称取12.9g Na2HPO4·12H2O和2.175g NaH2PO4·2H2O加去离子水混匀溶解，定容至1000ml。

配液2：0.04M磷酸（蜂蜜样本专用）

    1ml浓磷酸加去离子水混匀，定容至360ml。

配液3：1M NaOH（蜂蜜样本专用）

    称取4g NaOH加去离子水混匀溶解，定容至100ml。

配液4：1% 冰醋酸（禽蛋样本专用）

量取1ml冰醋酸加去离子水99ml混匀溶解。

配液5：70% 甲醇（禽蛋样本专用）

    量取700ml甲醇加去离子水300ml混匀溶解。

配液6：复溶液

将5×复溶液用去离子水5倍稀释（1份复溶液加4份水），用于样本的复溶，复溶液在4℃环境可保存一个月。

配液5:工作洗涤液

    将浓缩洗涤液20倍稀释(1份洗涤液加19份去离子水)。

5.3 样本前处理步骤：

5.3.1组织样本

1）称取2±0.05g去除脂肪的匀浆样本，加入8ml 0.05M PB缓冲液，振荡5min，置56℃水浴环境放置30min；

2）室温4000r/min以上离心10min；

3）取1ml上清液加入1ml正己烷，充分混匀，室温4000r/min以上离心5min；

4）去除上层有机相，取50ul下层液，加入450ul 稀释后的复溶液，混合30s；

5）取50ul用于分析。

    样本稀释倍数：40     检测下限：4ppb

5.3.2 蜂蜜、蜂王浆

1）称取2±0.05g 样本，加入4ml 0.04M磷酸，振荡至完全溶解，室温4000r/min以上离心5min，直至清亮。（蜂蜜样本可不用离心直接进行第2步）；

2）加入450ul 1M NaOH将PH值调至7-9之间(蜂王浆样本需将全部上清移至另一干净离心管中调节PH值至7-9之间)，室温4000r/min以上离心5min ，直至清亮；

3）取50ul上清液，加入450ul稀释后的复溶液混匀，混合30s；

4）取50ul用于分析。

    样本稀释倍数：20     检测下限：2ppb

5.3.3 牛奶、奶粉

1）称取2±0.05g样本，加入8ml 0.05M PB缓冲液，振荡5min，置56℃水浴环境放置30min；

2）室温4000r/min以上离心10min；

3）去除上层脂肪，取50ul中层澄清液体，加入450ul 稀释后的复溶液，混合30s；

4）取50ul用于分析。

    样本稀释倍数：50     检测下限：5ppb

5.3.4 禽蛋

1）将禽蛋去皮打破后均质，取1g±0.05g于50ml离心管中，先加入体积分数为1%的冰醋酸2ml，振荡2分钟，再加入体积分数为70%的甲醇7ml，振荡2分钟，室温4000转/分离心10分钟；

2）取上层液0.1ml于1.5ml离心管中，加入0.9ml复溶液，振荡混匀30s，取50ul分析。

样本稀释倍数：100    检测下限：10ppb

6 酶联免疫试验步骤

    将所需试剂从4℃冷藏环境中取出，置于室温平衡30min以上, 洗涤液冷藏时可能会有结晶需恢复到室温以充分溶解，每种液体试剂使用前均须摇匀。取出需要数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。

6.1编   号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。

6.2加样反应：加标准品或样本50?l/孔到各自的微孔中，然后加抗体工作液50?l/孔，轻轻振荡5秒混匀，25℃避光反应30分钟。

6.3洗   涤：小心揭开盖板膜，甩去孔内液体，每孔加350ul工作洗涤液，静置30秒后弃去，重复洗涤5次，一次拍干。（用吸水纸拍干，拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。

6.4加酶反应：加酶标记物100?l/孔，25℃避光反应30分钟。

6.5洗   涤：同上

6.6显   色：加底物液A 50?l/孔，再加底物液B 50?l/孔，轻轻振荡5秒混匀，25℃避光显色15分钟（若蓝色过浅，可适当延长反应时间）。

6.7 终   止：加终止液50?l/孔，轻轻振荡混匀，终止反应。

6.8 测吸光值：用酶标仪于450nm处测定每孔吸光度值（建议用双波长450/630nm）。测定应在终止反应后10分钟内完成。

7 结果分析

7.1 百分吸光率的计算

    标准液或样本的百分吸光率等于标准液或样本的百分吸光度值的平均值（双孔）除以di 1个标准液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即

A—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

A0—0ppb标准溶液的平均吸光度值

7.2 标准曲线的绘制与计算

    以标准液百分吸光率为纵坐标，对应的标准液浓度（ppb）的对数为横坐标，绘制标准液的半对数曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中待测物的实际浓度。

    若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。（欢迎来电索取）

原创作者：湖南鑫泰环保科技有限公司