A、请问各位高手,在进行免疫荧光的实验时,浸一抗之前,要用的封闭液中1%的BSA是怎么配制? 封闭液封闭后还用PBS 清洗干净再浸一抗吗?

1.可以直接用0.02M的PBS 配制

2.不用PBS 清洗干净，直接浸一抗。

B、各位高手，间接法中我想摸索封闭液BSA的zui佳浓度，用抗原 包被后，用不同浓度的BSA(0.5%，1%，2%，3%)封闭，其他条件固定，测得 OD450nm后，可以看出随着BSA浓度增高，空白值降低，待测样品的OD450nm值也降低，，应该如何确定BSA的zui佳浓度?

Q1、你的BSA 浓度是否太高?zui常用的封闭剂是0.05%-0.5%的BSA，封闭是否必要，取决于ELISA的模式及具体的实验条件。并非所有的ELISA 固相均需封闭，封闭不当反而会使阴性本底增高。一般说来，双抗体夹心法，只要酶标记物是高活性的，操作时洗涤彻底，不经封闭也可得到满意的结果。特别是用单抗腹水直接包被，因其中大量非抗体蛋白在包被时同样也吸附在固相表面，业已起到了类似封闭剂的作用。但在间接法测定中，封闭一般是不可少的

Q2、判断封闭条件，要考虑在此条件下是否能达到试验要求，即棋盘滴定要满足：阳性样品OD=0.8、阴性样品OD<=0.1，而不是看你待测样品OD变化趋势;

过低封闭浓度势必造成本底过高，但过高又会使灵敏度降低，因此只要选择能够满足你试验要求的zui低BSA浓度就可以了。

另外提醒，洗涤一定要彻底，很重要的。

Q3、包被后封闭前一般要洗涤一遍，以便于洗掉结合不牢固的包被物，防止在实验中影响实验结果;封闭后一定不要洗涤，封闭的目的就是要靠蛋白填补未被包被物占领的空间，另外封闭液一般也具有保护作用。

C、新生牛血清(细胞培养时候加到1640的那一种)可以么，用多大的浓度配比较好啊，是用双蒸水配吗??

Q1、5%，TBS配，BSA是牛血清蛋白，粉剂，不是牛血清哦

Q2、如果不是用biotin-avidin系统的话，用5%脱脂奶粉做封闭液就可以了，廉价，效果也很好。

Q3、封闭液一般是用5%的BSA或者是用5%的脱脂奶粉，溶剂一般使用TBST。做实验的时候，我一直强调这样的一个原理，那就是在了解原理的基础之上，我们完全可以不拘泥于书本，进行创造。就拿这个封闭液来讲，要是单纯的一种封闭效果仍然不好的话，我们完全可以两种合用，我就试过1%的BSA和5%的脱脂奶粉合用进行封闭的事例。所以，搞科学研究是需要我们进行再创造的。

D、BSA交联抗原注射到兔子体内得到一抗，我们Elisa的二抗用的是羊抗兔HRP标记的二抗。请问，在封闭时，用什么样的封闭液比较好呢?是无蛋白封闭液，还是羊的免疫前血清?

Q1、用5%的脱脂奶粉就可以吧，溶到PBS里，加0.1%的吐温-20.

E、以前买的是专门的一抗稀释液，现在用完了，想换BSA液做封闭液用，因为牛奶太容易坏了，请问可以长期保存么么，谢谢诶，5%可以么，哈哈

Q1、5%BSA配完放冰箱就是了，不过BSA还是有点贵，脱脂奶粉挺好的，现用现配就是了

Q2、BSA确实有点贵,我们在牛奶中加千分之0.2的叠氮钠,放4度可保存2月左右

Q3、NaN3对HRP是强烈抑制剂，如果你使用的是HRP标记~建议要么更换防腐剂，要么延长洗膜时间和次数。其他防腐剂可以选择：硫柳汞钠、极少量的lu仿(1~2ul就可以)

Q4、BSA和牛奶一样，只要不臭，就可以反复使用，而且，有的高手提议放的时间长一点，效果反而更好，也许是溶解的更为彻底的缘故吧。

Q5、都一样吧，在不加防腐剂的情况下，两者的保存时间都不久。我们实验室是牛奶+叠氮钠，虽然用的是HRP，但只要洗膜时间有保证，一般问题不大。加了防腐剂的牛奶可以用蛮长时间的，一个月应该没问题吧。还有一点就是，有的蛋白用BSA会更好，有的蛋白则用牛奶会更好，这是我的个人经验，因为曾经用两种稀释液做过同一个样品同一个蛋白的western，结果证实牛奶的背景更干净，特异性更好，BSA的则会有杂带。

F、 请免疫荧光高手指点,我zui近做了两次的免疫荧光,均失败,可基本排除是抗体问题,我想问问荧光高手,其中免疫荧光中的封闭液(我用的是5%BSA)跟我的一抗有关吗?封闭液的选择是否和一抗的稀释液需相同,非常感谢!

Q1、封闭液对一抗的结合影响不大，失败的原因不应该是封闭液的原因。一抗可以用封闭液稀释。我们做的经验看，相对组化中一抗的浓度，荧光的稀释比例应该大，即假如组化是1：100，荧光可以试1：50。

G、我的包被的蛋白是用bsa偶联的二十四个多肽，我想问下我用什么做封闭液才行呢?

Q1、BSA或是酪蛋白的封闭液都行，封闭是为了封闭抗原没有占据的空白点，跟你的多肽用何种蛋白偶联没有任何关系!

H、小弟课题牵涉到ELISA检测血清中抗原，在网上看到封闭液的配方又很多种，由于经费有限，小弟想是否也可以效仿western blot 使用脱脂奶粉作配封闭液，不知各位有没有这方面的经验，或者能介绍一下又有效又实惠的配方

Q1、脱脂奶粉做封闭液是相当得可以，另外廉价的封闭液有BSA，酪蛋白等。都可以用来做封闭液。

Q2、放在瓶子里溶解，称量好干粉和其他的盐后，放到瓶子里使劲摇……让蛋白和盐结晶充分混合，再加水很快就溶了

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