学习用浓盐法从酵母中提取RNA

掌握用等电点法沉淀RNA

观察核酸的颜色反应，了解核酸定性与定量测定的原理

熟练掌握普通离心机的使用方法

 

二. 原理

酵母繁殖快，生长周期短；其细胞质中的核酸大部分是RNA，而DNA很少；RNA提取液与菌体分离比较容易。因此，酵母是提取RNA的好材料。

将RNA从细胞中释放出来在工业上主要有三种方法—稀碱法、浓盐法和自溶法。本实验采用浓盐法，即利用高浓度的盐（10% NaCl）在90～100°C条件下改变了细胞膜通透性，并将核蛋白体解离成RNA和蛋白质而使 RNA释放到盐溶液中。同时，90～100°C的高温可破坏磷酸单酯酶和磷酸二酯酶的活力，避免RNA的降解。注意，在30～70°C时这两种酯酶的作用活跃，提取时应避免在此温度范围内停留时间过长。由于核膜内的DNA分子量较大，穿越膜孔较困难，一般不易释放到菌体外面，所以采用离心技术，可使RNA 溶液与菌体残渣以及DNA分离。

 

根据核酸在等电点溶解度小的性质，将溶液在低温下调pH至2.0～2.5，RNA以白色絮状沉淀形式从盐溶液中析出。再次离心，固液分离，便可获得RNA粗产品。

/后用乙醇洗涤沉淀，溶解和去除脂溶性杂质和色素以及盐分杂质。由于RNA不溶于乙醇，所以用乙醇洗涤还可以使RNA沉淀物脱水，变得疏松，便于干燥，提高了RNA产品的纯度。

 

DNA和RNA的鉴别，较常用的方法是利用两类核酸中不同的戊糖各自具备的不同的颜色反应，而得以定性鉴别。其中鉴定DNA的方法称为二苯胺法，鉴定RNA的方法称为地衣酚（苔黑酚，3,5-二羟甲苯）法。具体反应式如下：

 

三. 实验材料及设备

1. 材料

干酵母

 

2. 仪器

离心机电子天平 沸水浴烘箱 抽滤装置 冰浴

 

3. 器材

普通试管： 20mL×4（干燥）

锥 形 瓶： 100mL×1

量 筒： 50mL×1

移 液 管： 1mL×2

烧 杯： 250mL×1 100mL×1 50mL×1

离 心 管： 100mL×1

温 度 计： 50℃×1

表 面 皿： f9cm

滴 管： 2

洗 耳 球： 2

加 样 器

pH试纸： pH0.5～5.0

滤 纸： f7cm

洗瓶、试管架、移液管架、试管夹、玻棒：各1

 

四. 试剂的配制

1. NaCl溶液（C.P.）（10%）

2. HCl溶液（6N）

取500mL浓盐酸，用水稀释至1000mL。

3. 乙醇（C.P.）（95%）

4. 苔黑酚试剂（又称地衣酚试剂）

将200mg苔黑酚溶于 100mL浓盐酸中，再加入100mg FeCl3·6H2O。

（低温贮藏一周）

5. 二苯胺试剂

将1g二苯胺溶于98mL冰醋酸中，再加入2mL浓硫酸（比重1.84）。

（临用时配制，用可加几滴乙醛。）

 

五. 操作步骤

1. 取材

在天平上准确称取干酵母3.00g，转移至100mL锥形瓶中。

 

2. 浓盐浸提

取 27mL 10%NaCl溶液，加入到含干酵母的锥形瓶中，搅拌均匀；置于90～100°C水浴中，浸提30～60分钟；冷却。

 

3. 离心

将锥形瓶中提取液和沉淀全部转移至100mL离心管中，取10mL H2O洗涤锥形瓶，并入离心管中；平衡后以4000转/分钟离心 15分钟；将上清液（即RNA提取液）倾入50mL烧杯中，弃去沉淀（菌体残渣）。

 

4. 沉淀RNA

(1) 冷却：将50mL烧杯置于放有冰块的250mL烧杯中冷却；将温度计插入50mL烧杯中，待溶液冷至10°C以下时，取出温度计。

(2) 调pI：缓慢滴加 6NHCl于50mL烧杯中，用玻棒一边轻轻搅拌溶液，一边测量pH值，调节溶液pH至2.0～2.5范围，溶液中白色沉淀逐渐增多，到等电点时沉淀量多；继续在冰浴中静止15分钟，使沉淀充分。

（注意：①严格控制pH；②若搅拌过快核酸难以凝聚沉淀。）

 

5. 离心

将小烧杯中溶液和沉淀移至离心管中，再次平衡、离心（4000转/分钟，15分钟）；弃去上清液，保留RNA沉淀。

 

6. 洗涤与抽滤

(1) 洗涤：取10mL 95%乙醇加到含RNA沉淀的离心管中，悬浮沉淀，浸泡5分钟。

(2) 抽滤：取大小合适的滤纸，先在数字显示天平上称重；然后放入布氏漏斗中，用少量乙醇湿润滤纸，开启真空泵，使滤纸贴紧漏斗，将沉淀及溶液全部转移至布氏漏斗内；再用15mL 95%的乙醇洗涤离心管，淋洗滤渣。

 

7. 干燥

用小镊子取出布氏漏斗中的沉淀物和滤纸，转移至表面皿上，置于80°C烘箱内干燥。

 

8. 称重

取出样品，在室温下冷却数分钟后，将沉淀物及滤纸置于数字显示天平上称重。

 

9. 颜色反应

(1) 溶解：取50mL水溶解RNA沉淀，同时加2滴NaOH助溶。

颜色反应：取4支洁净、干燥的试管，按下表所示顺序操作

 

六. 结果处理

 1. 写出核酸产品的颜色和外形。

 2. 计算RNA的粗产品的得率。

 3. 由颜色反应的结果，说明产品中含有核酸的情况。