亲和素生物素复合物法（ABC法）

(1）冰冻切片用0.0lmol/L PBST（或PBS）漂洗或冲洗3次，每次5min。

(2) 3 % H2O2孵育l0min（耗竭内源性过氧化氢酶），再用0. 0l mol/L PBS冲洗3次，每次5min,

(3) 5％-8％的正常动物血清（山羊或马血清）孵育30-60min,封闭组织片的非特异性结合。

(4）洗掉血清，滴加合适浓度的抗，如1 :500 (0. 01 mol/L PBS配制），4℃过夜。

(5) 吸出抗，0. 0 1 mol/L PBS冲洗3次，每次5min，加入同源性的二抗（0. 0l mol/L PBS配制），室温2h（好在摇床上进行）。

(6）吸出二抗，0. 01 mol/L PBS冲洗3次，每次5min，加入三抗(0. 0lmol/L PBS配制），室温2h（在摇床上进行）。

(7) DAB显色。显色结束后，0. 1 mol/L PB洗2次，每次5min,终止显色。

(8) 切片（漂染还需要裱片）脱水、透明：70%、80%、90%、100％酒精各5min，二甲苯（1)、 (2）各10min，中性树胶封片。典型的实验结果见图20. 2A。

注意事项：

(1) 准备：免疫组织化学要求实验器具绝对无污染，因此，所使用的玻璃器皿、载玻片、盖玻片均需在浓酸中处理至少24小时，取出后自来水冲洗干净，用蒸馏水浸泡，再取出晾干备用。实验中尽量避免交叉使用吸管和移液器枪头等。

(2) 切片注意事项：切片开始，要先将组织冷冻，可置入液氮中停留数钟（用锡纸包裹）迅速冷冻。使用冷冻式切片机，刀片及接触冰冻切片的物体需要预冷。如使用次性刀片需及时更换，非次性刀片要注意保养，微小的缺口也可能造成组织切片出现划痕，影响实验结果。

(3）根据蛋白所在的位置，选用PBST或PBS，如果蛋白在细胞膜上，则不推荐加入Triton X-100；如果是核内的蛋白，可适当增加Triton X-100的浓度。

(4) H2O2的作用是用来耗竭内源性的过氧化物酶，组织内的过氧化物酶可催化显色的底物，从而造成假阳性或增加背景。如果组织冲洗不够充分或染色背景较高，可适当延长其孵育的时间或提高H2O2的浓度。

(5）封闭用的血清应与产生二抗的动物同源，从而达到消除非特异性染色的目的。

(6) 抗的选择至关重要，多克隆和单克隆抗体各有优点，抗体的选用应根据具体的目的，详细阅读抗体的说明书，并寻找可能的文献作参考。抗的浓度及时间，要在预实验时进行梯度的筛选，以推荐浓度作为中间浓度，上下调整抗的浓度。理想的染色结果应是无背景而只有抗原显色。二抗的浓度也应进行适当的摸索。抗体的保存和使用，应参照说明书。

(7) DAB定要现用现配，尽量避光保存。显色的时间应在镜下控制。

(8) 免疫组化的对照实验必不可少，对照可分为阴性对照和阳性对照，阴性对照指用缓冲液代替抗，而其他步骤不变。阳性对照般用常见的蛋白如细胞骨架蛋白（actin)或者用不同的组织（如说明书上所用的）进行同抗体的染色。

原创作者：上海岑特生物科技有限公司