原因：

 

1、引物特异性差

 

2、模板或引物浓度过高

 

3、酶量过多

 

4、Mg2+浓度偏高

 

5、退火温度偏低

 

6、循环次数过多

 

提高扩增效率和PCR的特异性方法

 

引物

 

引物设计：引物长度适当，18-24mers，并保/证序列独特性，以降低序列在非目的片段中存在的可能性，但长度大于24核苷的引物并不意味着有更高的特异性，较长的序列可能会与错误配对序列杂交，反而降低特异性，而且长序列比短序列杂交慢，影响产量； 引物浓度：引物的浓度会影响特异性。/佳的引物浓度一般在0.1到0.5μM。较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。 

 

Mg2+

 

较高的Mg2+浓度可以增加产量，但也会降低特异性。为了确定/佳浓度，从1mM到3mM，以0.5mM递增，进行适Mg2+浓度测定

 

退火温度

 

Tm对于设定PCR退火温度是必需的。退火温度一般设定为比引物的Tm低5℃的温度。合理的退火温度为55-70℃。在理想状态下，退火温度应足够低，以保/证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。

 

巢式PCR

 

使用巢式引物进行连续多轮扩增，由于同两套引物都互补的靶序列很少，巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，从而提高PCR反应的特异性和灵敏度

 

递减PCR

 

通过在PCR的几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm高大约5℃的退火温度下开始，然后每个循环降低1℃到2℃，直到退火温度低于Tm 5℃。这样，特异性/高的目的模板会被优先扩增，并在随后的循环中继续扩增占据优势

 

热启动PCR

 

通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR 仪达到变性温度。常用的是热启动DNA 聚合酶，常温时该酶活性被抑制，94-95℃加热数分钟后回复正常活力开始反应，这样可以避免起始循环温度下的非特异性扩增，大大提高了PCR反应的灵敏度及特异性。热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性重要的方法

 

PCR增强剂

 

包括甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱等，能构降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸通过二结构区。