革兰氏染色法，是指细菌学中广泛使用的一种重要的鉴别染色法，属于复染法。这种染色法是由丹麦医生革兰于1884年所发明，初是用来鉴别肺炎球菌与克雷伯肺炎菌。革兰染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤。未经染色的细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下难区别。经染色后，阳性菌呈紫色，阴性菌呈红色，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，从而用以分类鉴定。染色原理：通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细菌细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，再用95%乙醇脱色。
 

　　革兰氏染色液用水：培养基制备用水应使用电阻率不小于30万Ωcm的蒸馏水或与其同质的水，不使用离子交换器生产的去离子水。

　　称量：称量时需用多功能的角匙，预防交叉污染而影响检验结果；干粉培养基易吸潮，如有条件，尽量在湿度较低的房间称取培养基。

　　复水：复水时不可用铜锅或铁锅，防止有离子渗入培养基中，影响微生物的生长；容器的大小需大于复水后培养基总体积的2倍以上，避免在加热溶解过程中，培养基溢出；含有琼脂粉的培养基，在加热溶解之可以浸泡数分钟；加热培养基时一定要进行搅拌，特别是琼脂类培养基。

　　为避免烧焦和沸腾溢出，对于少量的培养基使用沸水浴进行加热。烧糊的培养基营养物质被破坏，并可产生有毒物质，如发现焦化，或未溶解均匀培养基有溢出，该培养基即不能使用，应重新制备。

　　灭菌：通常培养基采用湿热灭菌，即高压蒸汽灭菌，通常是121℃ 15 min，含糖或特殊培养基，按照国家标准或生产商提供的说明灭菌。已配制好的培养基必须立即灭菌，预防微生物生长繁殖而耗费养分，改变培养基的酸碱度。

　　高温可破坏培养基的营养成分，还会使琼脂的凝胶强度下降，因此必须严格控制灭菌温度和时间，并且不可重复灭菌。高压蒸汽灭菌锅的压力表等要定期进行检定，并定期采用生物指示菌法或化学变色纸片对灭菌效果进行验证。

　　pH测定：细菌必须在适宜的pH范围内能够正常生长繁殖或体现其生物特性。培养基配方要求的pH为灭菌或消毒后的pH 值，即培养基使用的pH，并应在25℃温度下选用精密酸度计进行测量，固体琼脂培养基应以特殊的胶体表面测量电进行测量。应用过程中，如果需要调整培养基的pH，应用1mol/L Na0H或 lmol/L HCL调整，留意不可反复调pH，否则会影响培养基的渗透压。

　　配置好的培养基保存：灭菌以后培养基应该迅速冷却至所需温度，避免长时间保存在灭菌锅内，导致过度灭菌，影响培养基的营养成分或选择性效果。所配制的培养基的量，应该是在长保存期限内正好使用完。含染料的培养基应闭光保存；倒好的琼脂平板如果配制的当天未使用完，应当冷藏保存，如果保存时间超过2天，应将其放入密封的塑料袋中保存。

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