养细胞真的是磨练人性格的一项工作。细菌真菌支原体各种污染都经历过了，能把癌症细胞养到绝种也是很无奈生活的阅历就是大的智慧，所以天跟大家汇总了细胞间常用的无菌技术操作指南如下:
 

1、我们要挑选了一个平时很少有人用的实验室作为无菌室，超净台不能放在靠近门口和窗户的位置，这个区域要保持干净无灰尘。为保证超净台工作面的无菌，使用需用75%的乙醇擦拭工作面。

2、每天实验开始时候，超净台/实验间 照20分钟紫外是不错的选择。拿培养瓶和培养液时候请托下面拿，切忌不要拿瓶颈部位。

3、工作和工作后，都要对超净台进行擦拭，特别是有液体溢出的地方。各种盛装液体的瓶子从冰箱内拿出来后，都要用75%乙醇进行擦拭。为确保无菌操作，好每次使用之也要再进行擦拭。

4、在操作过程中，超净台上的所有物品需摆放整齐。整齐的原则是：需要的东西要很容易拿到，拿东西的时候不能跨越其他物体；超净台内的物品不宜过多，否则会影响无菌空气的层流；实验完毕后擦拭整个超净台面，并移走所有物品。

5、对于我们从试剂公司购买的培养基、血清或者其他试剂，一定是经过厂家的质量监控保证无菌的，但是盛装试剂的瓶子外表不是无菌的。所以在实际操作中，要在超净台下拆下外包装，每次使用需用75%乙醇擦拭。（在这里提出一点疑问，有很多人说培养基和血清不能照紫外，也有人说二者是可以照紫外的，希望有大神帮忙回答一下）

6、从其他实验室借来的细胞，因为无法保证原来的实验室或运输途中是否有污染情况出现，所以先要在没有抗生素的情况下，和本实验室的细胞分开培养一段时间，直到证明它们没有被污染再放到同一空间。

7、如果不是大批量培养细胞，我们会用广口瓶配制盛装培养基。广口瓶特有的深螺旋盖子防污染的效果很好，但是清洗的时候要特别注意，以防瓶盖内残留的液体没有清洗干净。

8、培养皿的敞口时间不易过长，不要在敞口的培养皿及培养皿的上方操作。当把培养皿从培养箱拿出或放入培养箱中时，小心不使它们倾斜或受到摇晃，避免培养基进入盖子和皿身的夹缝中。如果不小心出现上述情况，应用75 % 乙醇擦掉溢出的培养基，并更换新的盖子。

9、虽然我们在操作的过程中会带无菌手套，穿无菌服，但是个人卫生也是很重要的一点。手部的清洁可以湿润皮肤，洗掉一些微生物，带走某些皮肤干屑。如果女生是长头发，也要盘头或马尾系在身后。如果患有感冒，好在感冒好之不要进行细胞培养工作，即使带上口罩，也不能阻挡感冒病毒。

10、玻璃吸管或塑料吸管是转移液体/方便的途径。灭菌，要在玻璃吸管的吸口端加一个棉塞，这个塞子能起到防止液体回流造成交叉污染的作用。

11、污染可以从一个小范围或一个培养皿扩散到几个培养皿，乃至整个培养箱中。观察培养皿中细胞状态的时候，一定要肉眼和显微镜双重仔细观察；不能与其他实验人员公用同一个瓶子，不同种类的细胞系哪怕培养基相同，也不能使用同一个瓶子。

12、在操作过程中，打开和关上瓶盖的后都需要在酒精灯火焰旁灼烧瓶口和瓶盖。由于空气对流的原因，在火焰旁操作，火焰旁的空气向上走，可以减少附近区域灰尘下降。

13、超净台之所以会营造出一个无菌的环境，是因为里面有持续稳定的过滤气流通过超净台面。水平式超净台的气流是从实验人员的对面吹出，与台面平行。垂直式超净台的气流是从顶部向下吹的台面，被吸入后循环利用。所以对于垂直式超净台的实验人员来说，操作时不要在开口的上方操作；而对于水平式的超净台，实验人员尽量不要在开口的后方操作。

14、水平式超净台可以提供相对稳定的气流，对培养物和试剂的无菌保护作用较强。但是垂直式给予实验人员的保护更多。

15、在操作过程中，不要把液体从一个瓶子倒入另一个瓶子中，因为这种倾倒方式会将让液体变成连接瓶内外空气的桥梁。即使瓶子是无菌容器，这种方式也会增加污染的风险。

16、水浴锅很脏，生化培养箱要是得手动加湿的话盘里的水也会很脏，勤换 (灭菌水加进去)。

17、操作时要常更换吸管，切勿一根吸管做到底。一旦发现吸管口接触了手和其他污染物品应弃去。实验完毕及时收拾，保持实验室清洁整齐，后用消毒水浸泡的纱布擦台面。

18、离开过操作台的东西再进操作台定要用酒精喷一遍，包括一切实验耗材、仪器、以及你带着手套的手。实验结束后对实验台的消毒。紫外什么的，用用后都照个 30 分钟。

19、不管买的细胞、惠赠的细胞，刚拿到手赶紧做两件事：检测是否有支原体污染； 迅速扩增冻存。

20、发现有污染迅速处理掉，特别是当你养了很多种细胞时； 细菌污染，真菌污染很容易发现，支原体污染的话，细胞会长的慢，买个支原体检测的 kit 定期检测一下。

21、细胞只要是被细菌污染了，不管用PBS冲洗多少遍，无论是否用高浓度抗生素处理多久，只要抗生素一撤，污染的细菌必会暴发，唯1能做的就是扔掉这盘细胞。

22、非常珍贵的肿瘤细胞被细菌污染了并且没有冻存备份怎么办？可以尝试小鼠皮下接种，待皮下接种成功后，取下肿瘤消化继续培养，小鼠体内的免疫系统会清理掉细胞中污染的细菌。

23、如果细胞反复污染，记住一定不是操作问题，一定是有污染源，请仔细寻找污染源：培养基、血清、胰酶、培养瓶…，可以提取上述试剂在新的培养基中进行培养，观察哪一组能培养出细菌。/简单粗暴但又快捷的方法就是将所有的细胞培养的试剂和器皿换成新的。

细胞污染是非常头疼的一件事情，祝大家细胞培养顺利！
 

原创作者：上海岑特生物科技有限公司