小鼠elisa试剂盒测定操作过程

一、原理与意义

通过抗原和抗体在体外特异结合后出现的各种现象,对样品中的抗原或 抗体进行定性和定量检测。本实验采用双抗体夹心ABC-ELISA法,用抗小鼠单抗包被于酶标板上,标准品和样品中的TNF-a与单抗结合,加入生物素化 的抗小鼠抗体,形成免疫复合物连接在板上,辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(Streptavidin)与生物素结合,加入酶底物邻苯二胺(OPD),出 现黄色,加终止液浓硫酸,颜色变深,在492nm处测OD值,TNF-a浓度与OD值成正比,可通过绘制标准曲线求出标本中TNF-a浓度。它是样品中蛋 白质含量检测的定性和定量方法。

二、试剂盒的组成

96/48微孔板(1块,已包被抗小鼠TNF-a单抗)、样品稀释液(1 瓶)、抗体工作液(1瓶)、酶标抗体工作液(1瓶)、底物稀释液(1瓶)、终止液(1瓶)、洗涤液(20×,1瓶)、标准品(2000 pg/ml,2管,冻干粉)、OPD片(3片)、坐标纸(1张)。

三、实验准备工作

1、试剂配制:洗涤液按1:20三蒸水稀释;标准品在用前每管加入200 ?l蒸馏水溶解即可(具体见说明书);底物工作液应在显色前5-10 min将OPD片放入底物稀释液中溶解,每片加5 ml液。

2、 标本收集:采集血清或体液尽早检测,2~8 ℃保存一天需更长时间须冷冻(-20℃)保存,避免反复冻融;组织(胎肝、胎脑等)实验前一天组织匀浆,用90%体积RIPA裂解液(PH 8.0,50 mM Tris HCl、1% NP-40、,0.25% sodium deoxycholate、150 mM NaCl、1 mM EDTA)和10%体积的10 mM PMSF进行组织匀浆(10%),冰上裂解30 min,12000×20min后取上清,4℃待用。

3、器材准备:酶标仪、37 ℃恒温烤箱、滤纸、托盘、量筒、烧杯、各种规格的移液器、离心管、管架和废液缸等。三蒸水自备。