实验方法原理     利用差速离心，将线粒体从其他亚细胞结构中分离出来，再用蔗糖梯度离心进一步纯化得到线粒体。用核糖核酸酶 A 处理从中去除叶绿体 RNA，然后加入高浓度硫氰酸胍灭活核糖核酸酶 A，硫氰酸胍作为一种蛋白变性剂可非常有效的灭活核糖核酸酶 A。通过 CsCl 梯度离心，线粒体 RNA 沉淀下来。*后用 LiCl 沉淀法，将 CsCl 梯度离心中共沉淀下来的单链 DNA 是从线粒体 RNA 中除去。

实验步骤     

一 材料与设备

溶液均用 DEPC 水配制：

1)5.7moI/LCsCl 溶液。

2)10 mmol/LEDTA,pH7.5

3)DEPC 水

4) 变性缓冲液：50% 甲酰胺，12% 甲醛，IXMOPS 缓冲液（40 mmol/LMOPS,10 mmol/L 乙酸钠，lmmol/LEDTA,pH7.0)，用前新鲜混合。

5)lmg/mlEB

6) 抽提缓冲液：0.35mol/L 山梨醇，50 mmol/LTris-HCl(pH8.0).5 mmol/LEDTA，0.1%BSA,0.25 mg/ml 精胺和亚精胺，储存于用前加巯基乙醇至终浓度 0.2%。

7)4mol/L 硫氰酸胍：100 mmoI/LTris-HCl(pH7.5)，用前加巯基乙醇至 1%(终浓度），4°C 保存。

8)7.5mol/L 盐酸胍：含 10 mmol/LDTT,NaOH 调至 pH7.5, 过滤 4℃ 保存

9)2mol/L 和 4mcL/LLiCl，4℃ 保存

10) 上样缓冲液:50% 甘油，0.25% 溴酚蓝，lmmol/LEDTA。

11)10XMOPS 缓冲液：0.4moI/LMOPS，0.lmol/L. 乙酸钠，10 mmol/LNa2EDTA，pH7.0。

12)2mol/L 乙酸钾：pH5.

13)2mol/L 乙酸钠：pH7.5。

14)5% 十二烷基肌氨酸钠。

15)TE 缓冲液：10 mmol/L—Tris-HCl(PH8.0)，1 mmol/LEDTA

16) 洗脱缓冲液：350 mmol/L 山梨醇，50 mmol/LTris-HCl(pH8.0)，20 mmol/LEDTA

17) 匀浆器



二 操作方法

1. 线粒体的分离

所有步骤均在℃ 进行。溶液. 试剂瓶等要置于冰上。

1) 从油菜或其他植物中采集 4〜6 周的新鲜绿色叶子 20 g. 剪碎，置于 200 ml 冰冷的抽提缓冲液中冷却。

2) 在匀浆器中岛速匀浆组织三次〔每次匀浆每次间隔 l0S)。用两层滤膜将匀浆滤入 250 ml 冷的离心瓶中。

3)2000 g 离心过滤物 lOmin。小心地将上清液移入另一新管，10000 g 离心 20 min

4) 将沉淀再悬浮于 100 ml 柚提缓冲液中，重复步骤 3)—次。

5) 将线粒体沉淀再悬浮于 20 ml 冷的洗脱缓冲液中

6) 将每 10 ml 线粒体悬浮液，小心地置于蔗糖梯度的上面（蔗糖梯度组成为：9 ml0.9mol/L，11 ml1.5mol/L,9 ml1.75mol/L，蔗糖溶于洗脱缓冲液中）8O000 g 离心 60 min. 用宽孔吸管从 0.9mol/L 和 1.5mol/L 蔗搪界面 (黄带）收集线粒体，用 5 倍的洗脱缓冲液稀释 15〜20 min

7)10000 g 离心 20mim 沉淀线粒体。将线粒体沉淀再悬浮于 1 ml 冷的洗脱缓冲液中。




2. 线粒体 RNA 的分离

1) 将线粒体与 20ug/ml 核糖核酸酶 A 于冰上共同孵育 60 min

2) 向线粒体中加入 5 倍体积的 4mol/L 硫氰酸胍。60s 后室温下加入 0.5 倍体积的 5% 十二烷基肌氨酸钠，混匀。5000 g,5 min 离心混合物，除去不溶件残余物。

3) 将每 3.2 ml 混合物置于 1.lmlDEPC 处理的 5.7mol/LCsCl 溶液中。

4)22000 g 超速离心 14 h。

5) 仔细吸出上清液，并将与匀浆接触的离心管的上部切除 (所有步骤应避免手上的核糖核酸酶 A 的污染）

6) 加人 lml7.5mol/L 盐酸胍，充分混匀，溶解 RNA 沉淀。

7) 混合物内加入 0.05 倍体积的 2mol/L 乙酸钾（PH5.5) 和 0.5 倍体积的乙醇。

8)〜20℃ 孵肓 4 h.5000 g 离心 lOmin，沉淀线粒体 RNA

9) 加入 0.1 倍体积的 2moL/L 乙酸钠 (pH7.0) 和 2.5 倍体积的乙醇，-20℃ 过夜，10000 g 离心 30 min。

10) 用 70% 乙醇洗涤线粒体 RNA, 真空干燥，溶解于 0.5 mlTE。

11）为获得不含单链 DNA 的线粒体 RNA, 加入等体积的 4mol/LLiCl 溶解 RNA,4℃ 孵育过夜，10000 g 离心 20 min. 用 2mol/LiC1 洗涤一次，70% 乙醇洗涤两次。

12) 真空干燥线粒体 RNA, 溶解于 DEPC 处理过的水中。测量 260nm 的吸光度佔算线粒体 RNA 的得率 n

13) 为长期储存，在线粒体 RNA 中加 0.3 倍体积的乙酸钠，2.5 倍体积的无水乙醇, 存放于每克新鲜叶子可提取 0.3〜0.5ug 线粒体 RNA.


 
注意事项     
1) 操作过程中戴塑料或乳胶手套，所有试剂仅用于 KNA 提取，避免核糖核酸酶的污染。所有的玻璃器皿在 160℃ 处理 4 h。所用的塑料器皿用硫氰酸胍处理后，浸于 0.2%DEPC 水中 12 h, 高压消毒。

2) 为蔗糖梯度离心准备的梯度液应 4℃ 过夜平衡。梯度离心后，将洗脱缓冲液缓慢加人到收集到的线粒体中（15〜20mim), 这可减少渗透性休克。

3) 由于单链 DNA 与 RNA 在梯度中同时沉淀下来，所以要获得纯化的 RNA 必须进行 2moL/LiC1 沉淀

4) 可直接用纯的甲酰胺试剂。若出现黄色, 用 5%（m/V) 树脂 501-X8(D)(BioRad) 处理 lh 以去除离子。过滤后的去离子甲酰胺应储存在-70°C