一度被认为是*准确的基因表达检测方法，如今RNA测序的重复性却遭到质疑。

RNA测序是遗传学家工具箱中的一种常用工具。利用RNA测序，研究人员能够定量地检测各种生物体的基因表达，从而更好地了解细胞中正在发生的事情以及特定基因的功能。由于在药物发现、疾病诊断和基因鉴定中具有潜在作用，RNA测序的应用似乎无极限。

RNA测序的准确性

早在2014年，《Nature Biotechnology》上发表了三篇文章。它们属于RNA测序质量控制（SEQC）项目的一部分，旨在评估新一代测序平台的性能以及RNA分析的优势和局限。研究人员测试了三个常用RNA测序平台的可靠性、准确性和信息内容，希望确定平台的使用范围并寻找变化的来源。

在整个研究过程中，三个研究机构都产生了超过10亿个核苷酸的数据。他们还研究了30个不同的RNA测序实验室所使用的技术以及数百名研究人员使用的生化方法。总的来说，他们认为RNA的提取和分析可以跨机构圆满完成，即使样本已严重降解，但是遗传数据仍然可靠。

这些结果让研究机构以及医生患者放心，RNA测序是准确且可靠的。一项研究的负责人、梅奥诊所的E. Aubrey Thompson评论道：“患者的护理决策似乎受到基因组数据的影响，而这些数据来源于患者样本的RNA和DNA测序。如今我们知道了这些分析可在多大程度上依赖某个实验室。”

生物实验的重复性危机

如今，我们正处于所谓的重复性危机中，越来越多的研究变得难以重复，甚至不可能重复。据估计，单单就美国而言，每年花在无法重复的生物研究上的费用高达280亿美元。除了经济成本之外，不可重复的研究还造成药物开发的延误，阻碍疾病疗法的开发。

在设计实验和决定使用哪种技术时，重复性仍然是人们主要考虑的因素。可靠的方法通常是许多人的，比如RNA测序。然而，以色列特拉维夫大学的研究人员开展的荟萃分析表明，RNA测序的数据分析过程中存在技术偏倚，可能造成数据的错误解释和大量错误结果1。

RNA测序无法重复？

在分析了35个公开的RNA测序数据集之后，研究人员注意到某些基因反复呈现基因表达的变化。这些数据来自近年发表的人类和小鼠研究，覆盖了多个生物过程。他们对此感到困惑，想了解这一现象背后究竟是真实的生物学现象，还是实验过程引入的人为误差。

在其中30个数据集中，研究人员发现特别长或特别短的基因往往表现出*明显的基因表达水平变化。大多数短基因编码了组成核糖体的蛋白质，而许多长基因则编码了与细胞外基质有关的蛋白质。

经过进一步的研究，他们发现这种现象源于实验的人为因素，而不是天然的生物反应。在比较相同条件下的重复样本后，他们发现这种模式是由于技术偏倚，似乎与基因的长度有关。此外，若统计分析中存在缺陷，人们往往将检测到的偏倚错误地标为细胞反应，特别是与核糖体或细胞外基质有关的反应。在许多常用的数据归一化方法中，这种偏倚并未得到校正，因此可能已包含在许多数据集中。

这种效应被称为样本特异性长度效应（sample-specific length effect），之前已在文献中提到过。许多研究人员已经意识到这一问题，但没有积极地解决它。在此次分析的数据集中，未经校正的数据比例仍然很高。

不要低估统计分析的重要性

尽管乍一看让人担忧，但结果似乎也不是那么严重。在文中，研究人员还介绍了如何克服和消除这种偏倚，从而过滤掉错误的结果，保持生物学上的相关性。将基因长度视为样本特异性的协变量，可以明显减少假阳性结果的数量。

目前还不清楚哪些因素能够淡化样本特异性的长度效应，可能还需要进一步研究。作者建议研究人员在自己的研究中注意这种偏倚，并将建议的数据归一化方法作为默认步骤，应用在RNA-seq数据分析的标准实践中。

美国北卡罗来纳大学教堂山分校的生物统计学家Michael Love表示：“这篇文章很好地证明了质量控制的重要性。”他指出，还有一些偏倚也会影响RNA测序数据的质量，比如GC含量偏倚，各个研究团队在分析过程中应始终考虑这些因素。他本人并未参与此项研究。

这项研究强调称，所有技术都不是100%可靠的，因为偏倚的可能性始终存在。随着各个研究领域的重复性危机浮出水面并获得关注，这项工作强化了准确开展统计分析的必要性。