【实验目的】

（1）了解细菌对大分子物质水解的原理和方法。

（2）了解糖发酵、IMViC和H2S试验的原理和方法。

（3）通过不同微生物对不同物质的利用和代谢能力，认识微生物生理类型的多样性。

【实验原理】微生物代谢类型的多样性使得微生物在自然界的物质循环中起着重要作用，同时为人类开发利用微生物资源提供更多的机会与途径。微生物代谢类型多样性具体表现在生理生化反应的多样性。不同细菌具有不同的酶系统，分解糖类、氨基酸等有机物的能力各异，从而使产生的分解产物亦有不同。因此，借助各种生理生化反应可以鉴别细菌的种类，这是微生物分类鉴定的重要依据。

1．大分子物质水解微生物在生长繁殖过程中需要不断地从外界环境中吸收营养物质。环境中的大分子有机物必须经微生物分泌的胞外酶将其分解为小分子有机物才能被细胞吸收利用。不同的微生物分解利用生物大分子的能力不同，只有那些能够产生并分泌胞外酶的微生物才能利用相应的大分子有机物。微生物是否具有利用某种大分子物质的能力，可通过观察细菌菌落周围的底物变化来判断，如淀粉遇碘液会产生蓝色，但在细菌水解淀粉的区域，用碘测定不再产生蓝色，表明细菌能水解淀粉。

2．糖发酵试验糖发酵试验常用于鉴定细菌对葡萄糖和乳糖等单糖的利用能力。绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源，但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异。有些细菌产酸产气，有些细菌只产酸不产气。产酸情况一般用溴甲酚紫指示剂判别，产气情况则通过观察液体培养基中倒置的德汉氏小管是否有气泡来判断。

3．IMViC和H2S试验IMViC试验是吲哚试验（indol test）、甲基红试验（methyl red test）、伏-普试验（Voges-Prokauer test）和柠檬酸盐试验（citrate test）的缩写，主要用于水的细菌学检查。吲哚试验用来检测细菌对色氨酸的利用能力。有些细菌能产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸，产生吲哚和丙酮酸，吲哚本身无色，不能直接观察到，当加入对二甲基氨基苯jia醛试剂时，可形成红色的玫瑰吲哚，即吲哚试验阳性。甲基红试验用来检测细菌发酵葡萄糖的产酸能力。当细菌代谢糖大量产酸时，就会使加入培养基中的甲基红指示剂由橘黄色（pH6.3）变为红色（pH4.2），即甲基红反应阳性。伏-普试验用来测定某些细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物的能力。如产气肠杆菌发酵葡萄糖产生的丙酮酸大量进行缩合、脱羧，生成乙酰甲基甲醇，此化合物在碱性条件下能被空气中的氧气氧化成二乙酰，二乙酰与蛋白胨中精氨酸的胍基作用，生成红色化合物，即伏-普反应阳性。柠檬酸盐试验用来检测细菌利用柠檬酸的能力。有些细菌能分解柠檬酸形成CO2，同时由于培养基中钠离子的存在而形成碳酸钠，使pH升高。若用溴麝香草酚蓝作为指示剂，培养基颜色由绿色（pH6.0～7.6）变为蓝色（pH>7.6）时，即反应阳性。硫化氢试验用来检测某些细菌能否分解含硫氨基酸，生成硫化氢。硫化氢遇培养基内的铁盐或铅盐，则形成黑褐色的硫化铁或硫化铅沉淀物。黑褐色沉淀物愈多，表示生成的硫化氢量愈多。

【实验器材】

1．菌种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、大肠杆菌（Escherichia coli）、普通变形杆菌（Proteus vulgaris）、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）。

2．培养基淀粉培养基、明胶培养基、糖发酵培养基、蛋白胨水培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基、柠檬酸钠斜面培养基、柠檬酸铁铵培养基。3．试剂卢戈氏碘液、甲基红试剂、40％KOH溶液、5％α-萘酚、乙mi、吲哚试剂。4．仪器和用具培养箱、超净台、接种环、接种针、无菌培养皿、试管、试管架、记号笔等。

【实验步骤】

1．大分子物质水解

（1）淀粉水解

1）制平板：将淀粉培养基溶化后冷却至50℃左右，倒入无菌平皿，冷凝制成平板。在平皿底部用记号笔将平板划为二等份（视需要定，一般至多五等份）。2）接种：将枯草芽孢杆菌和大肠杆菌分别划线接种在zhi定区域，做上记号。3）培养：将培养皿倒置于37℃恒温箱中培养24～48h。4）观察：打开皿盖，滴加少量碘液于平板上，轻轻旋转，使碘液均匀铺满整个平板。如果菌落周围出现无色透明区，则说明淀粉已被水解。

（2）明胶水解明胶是一种动物蛋白，用其配制的培养基在低于20℃的温度下凝固，高于24℃的温度下自行液化。明胶在细菌产生的蛋白酶（胞外酶）作用下，可水解成为小分子物质，此时虽在低于20℃的条件下，亦不再凝固，而由原来的凝固状态变为液体状态。

1）接种：用穿刺法将枯草芽孢杆菌和大肠杆菌分别接种在2支明胶培养基试管中。2）培养：20℃下培养48h。3）观察：观察培养基是否液化（图6-1）。如果细菌在此温度下不能生长，则必须在所需的蕞适温度下培养。观察结果时需将试管从恒温箱中取出，置于冰浴或冰箱中，30min后取出立即倾斜试管，如试管中培养基部分或全部呈液化状态，表明试验菌为阳性；否则为阴性。

图6-1 明胶穿刺液化的观察

2．糖发酵试验

（1）葡萄糖发酵试验

1）接种：分别将大肠杆菌和普通变形杆菌接种于葡萄糖发酵培养基试管中，另取一支相同培养基试管不接种作为空白对照。注意：接种检查培养基，其中倒立小管应无气泡。2）培养：37℃培养，分别在24h、36h、72h时观察结果。3）观察：若糖发酵培养基中所含的葡萄糖而产酸，则指示剂使培养基由紫色（pH6.8）转变为黄色（pH5.2）；如果发酵葡萄糖时产酸兼产气，则培养基除变色外，倒置的德汉氏小管内有气泡产生。注意：应先确定细菌是否生长，若生长，则培养基变混浊。生长缓慢者需延长培养观察时间。

（2）乳糖发酵试验方法同上，所用培养基为乳糖发酵培养基。

3．IMViC试验和H2S试验

（1）吲哚试验

1）接种：分别将大肠杆菌和产气肠杆菌接种于蛋白胨水培养基试管中，另取一支不接种作为对照。2）培养：37℃培养24h。3）观察：在培养液中加入乙mi约1mL，充分振荡，使吲哚溶于乙mi中。静置片刻，待乙mi层浮于液面后形成明显的乙mi层，再沿管壁加入吲哚试剂8～10滴。如有吲哚存在，则乙mi层呈现玫瑰红色，为阳性反应；不呈现红色则为阴性反应。注意：加入吲哚试剂后试管不可再摇动，否则结果不明显。

（2）甲基红试验和伏-普试验1）接种：分别将大肠杆菌和产气肠杆菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养基试管中，连同空白对照置37℃培养24h。2）观察：取洁净空试管，将每支试管中培养液一分为二，分别用于甲基红试验和伏-普试验。3）甲基红试验：沿试管壁向培养液中加入甲基红试剂4～6滴，呈鲜红色者为甲基红试验阳性，呈橘黄色者为阴性。4）伏-普试验：在培养液中加入40％KOH溶液10滴，再加入等量的5％萘酚溶液，用力振荡，再放入37℃恒温箱中保温15～30min或在沸水中加热1～2min，如培养液呈红色为反应阳性。

（3）柠檬酸盐试验1）接种：分别将大肠杆菌和产气肠杆菌接种于柠檬酸钠培养基斜面上，另取一支不接种作为空白对照。2）培养：37℃培养24～48h。3）观察：观察培养基颜色变化，含有溴麝香草酚蓝的斜面呈蓝色者为阳性反应，呈绿色者为阴性反应。

（4）H2S试验

1）接种：穿刺接种大肠杆菌和产气肠杆菌于柠檬酸铁铵培养基中。2）培养：37℃培养24h。3）观察：沿穿刺线部位呈黑褐色者为阳性，颜色不变则为阴性。

【实验报告】1．实验结果将结果填入表6-1～6-3，以“＋”表示阳性反应，以“—”表示阴性反应。

表6-1 糖发酵试验结果

表6-2 大分子物质水解试验结果

表6-3 IMViC和H2S试验结果