传统的DNA提取方法

 

传统的DNA 提取与纯化,如 CTAB 法、SDS 法是在裂解细胞的基础上,多次苯酚氯仿等有机溶剂抽提使蛋白质变性沉淀于有机相,而核酸保留在水相,达到分离核酸的目的;加入RNA 酶除去核酸中的RNA; 然后加入异丙醇、乙醇等沉淀DNA;用70 %乙醇漂洗沉淀,除去分离过程中残留的有机溶剂和盐离子,以免影响核酸溶解和抑制后续步骤的酶促反应,后用TE 溶解DNA 备用。 CTAB 是一种阳离子去污剂,能与核酸形成复合物,此复合物在高盐( > 0. 7 mol/ L) 浓度下可溶,并稳定存在,但在低盐浓度(0. 1～0. 5 mol/ L NaCl) 下CTAB - 核酸复合物就因溶解度降低而沉淀,而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。通过有机溶剂抽提,去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。经离心弃上清后,CTAB - 核酸复合物再用70 %酒精浸泡可洗脱掉CTAB 。SDS 是一种阴离子去垢剂,在高温(55～65 ℃) 条件下能裂解细胞,使染色体离析、蛋白变性,同时SDS 与蛋白质和多糖结合成复合物,释放出核酸;提高盐(KAc 或NH4Ac) 浓度并降低温度(冰浴) ,使 SDS - 蛋白质复合物转变为溶解度更小的钾盐形式,使蛋白质及多糖杂质沉淀更加完全,离心后除去沉淀;上清液中的 DNA 用酚/ 氯仿抽提,反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。 SDS 法操作简单,温和,也可提取到高分子量的DNA ,但所得到的产物含糖类杂质较多。基因组DNA 经典的提取方法由于无需昂贵仪器和药品,提取的DNA 纯度能够满足一般分子生物学的需要,一直作为DNA 提取的常规方法。但这种方法操作步骤复杂,耗时长,易交叉污染,残留在DNA 溶液中有机物质对DNA 聚合酶有抑制作用。另外,酚、lv仿等有机溶剂易造成环境污染,有损操作者健康,因此使该方法的应用受到一定的局限性。

 

DNA提取新方法

 

近年来出现了以螯合树脂、特异性 DNA 吸附膜、离子交换纯化柱及磁珠或玻璃粉吸附等基础 DNA 提取新方法。这些方法主要应用于提取病毒、微生物、人和动物细胞、包埋组织样品、古生物标本及土壤环境样品 DNA 。已有多篇利用纯化柱和玻璃粉纯化植物基因组 DNA 的报道。马小军等将CTAB 液提取和氯仿抽提两步的上清液直接通过Wizard 纯化系统纯化得到的DNA ,RAPD 扩增效果良好,产率达2 250μg/ g 。张博等用硅珠(SiO2) 颗粒吸附DNA 纯化方法,从不同树木叶片中均得到了高质量的 DNA 样品 。黄椰林等对常规CTAB 法提取的DNA 用玻璃粉悬浮液纯化,所获DN 的APCR 产物能直接测序,比较适用于富含黏多糖、单宁、多酚和萜类化合物等次生代谢物的植物样品和长期保存的标本材料。袁长春等也用玻璃粉吸附法从富含酚类的茶类植物中提取纯净的总DNA。

 

目国内外开发了多种商品化的DNA 提取纯化试剂盒,其分离原理有的利用核酸的分子量差异,有的利用特异性膜与DNA 结合达到分离、回收的目的,如离子交换柱、磁珠等。这些试剂盒针对不同的材料来源设计了不同的提取方法,操作简单、高效, DNA 质量较高,但价格昂贵,提取量少。的国外的试剂盒生产厂家有Sigma2Aldrich、Promega、Invitrogen、 TaKaRa 、Whatman 等,它们针对不同来源的材料如微生物、动物体液、血液和组织、植物、加工产品、转基因产品等开发出一系列的试剂盒。

 

除此之外,由于核酸提取纯化试剂盒制作门槛低,还有大量的生物公司提供试剂盒产品,使用者一定要慎重选择。DNA 试剂盒经过了几十年的发展,已经不再局限于单纯的提取纯化,有些厂家推出了DNA 提取—扩增 PCR 试剂盒,将DNA 提取和PCR 扩增结合起来,大的提高了工作效率,如Sigma2Aldrich 公司的Sigma’s Extract2N2Amp Plant PCR kit 等。另外,还有高通量的DNA 提取产品,如高通量组织细胞研磨仪MM301 ,在常温和冷冻条件下对硬性、中硬性、韧性、脆性及纤维材料的研磨破碎,每次处理样品的个数可以多达48 个甚至192 个。美国应用生物系统公司6100 型核酸提取仪,可用于RNA、DNA 的提取纯化,可自编程序, 可选预设的程序,具有严格的防交叉污染体系,可从不同来源的样品中同时提取96 个样品。