1.  为什么免疫后没有效价或免疫后效价低？

答：可以从这几个方面一一考虑：

（1）设计的抗原与被免疫的动物内源蛋白有高的同源性或者抗原是免疫原性差的小分子物质。对于一种情况应该重新设计抗原，设计抗原时尽量选取目标蛋白特异性的序列，可以设计为短肽然后再与载体蛋白偶联之后免疫；对于后一种情况，先确认小分子物质是否已经正确地和载体蛋白偶联，如果偶联没有问题，可以更换其它的载体蛋白，一般来说KLH是所有载体中较为优先考虑的蛋白。

（2）免疫的周期不正确。免疫周期过长或过短，各免疫步骤之间的间隔过长或过短都有可能影响免疫效果，详细请参考本站有关动物免疫的部份，实际操作中的相关程序与本站推荐的程序相差尽里不超过50%的偏差。

（3）免疫佐剂不合适。TiterMax等佐剂在免疫时，对于某些抗原可能效果不佳，弗低佐剂也不能保证完全有效，此时可以考虑更换佐剂尝试。

（4）免疫剂量不合理。过大的免疫剂量可能导致免疫耐受，过少的免疫剂量可能无法激活免疫应答。一般来说，实际免疫剂量与本站所推荐的剂量不要相差两倍以上。

（5）免疫途径不合理。对于有些免疫原性弱的抗原，可以考虑脾内免疫方法，具体操作本站上也有详细的讲解。

（6）测效价的过程存在错误操作，尤其考虑包被是否成功或二抗使用是否正确。同时，一抗（即血清）稀释梯度尽量放宽，一般建议从1：500或1：1000开始作梯度稀释。对于小分子物质，效价达到1：2000仍可视为免疫成功。

2.  为什么融合后细胞不长或者融合后克隆很少？

答：可以从这几个方面考虑：

（1）免疫用的动物品系不正确或者品系不纯。免疫用的动物一般应该与骨髓瘤来源的动物是相同品系，例如使用SP2/0骨髓瘤细胞时应该选用Balb/C小鼠，同时必须使用品系纯正的小鼠。

（2）培养基中加入了过高浓度的HAT，或者仅A的浓度过高或HT的浓度过低，建议用纯的骨髓瘤和已有的杂交瘤作HAT浓度筛选。

（3）培养基不正确或血清浓度不正确或使用了劣质血清。

（4）未正确制备饲养层细胞。参见本站有关饲养层细胞制备的部份。

（5）接种杂交瘤细胞的培养板过多。一般在5-20块96孔板为宜。

（6）融合后，未及时转移或稀释细胞。有人在做融合后喜欢把融合的细胞先放在培养瓶中培养，然后再滴到96孔板上。如果在培养瓶中培养的时间过长，也可能出现克隆利率少的情况。

（7）细胞被污染。在显微镜下仔细观察是否有明显的微生物污染。即使看不到有明显的微生物，也应该考虑是否有支原体污染，有条件的可以做支原体检测。

（8）细胞培养条件不正确，确保细胞培养在恒定的37度较湿的环境，同时保证CO2浓度在4-5%左右。

（9）其它与融合条件相关的不恰当的因素。详见本站有关细胞融合的部份。

3.  为什么融合后得不到阳性克隆？

答：可能的原因：

（1）动物未免疫成功就进行了融合。具体解决方法参照本页面第1个问题。

（2）融合后得到的克隆较少，故得到阳性克隆的机率也较小。具体解决方法，请参照本页面第2个问题。

（3）筛选克隆手段不正确。例如有些小分子物质不可以直接包被到酶标板上，再如使用了不适当的二抗等诸多因素，也有人直接不使用ELISA作为筛选方法的，成功率也有待商榷。

（4）抗原成份与细胞培养条件中的物质相同或类似，或者与筛选过程中有同抗原结构相同或类似的物质产生了竞争反应。举个简单的例子，如果需要制备抗BSA 的单抗，则养杂交瘤的培养基中不可以使用牛血清，否则牛血清中的BSA直接与抗体相结合，后做ELISA筛选的时候无法得到阳性结果。解决的办法只有使用其它的动物的血清或者使用无血清培养基。再如，如果需要制备酪蛋白的单抗，则做ELISA筛选时，二抗的稀释液不可以使用脱脂奶粉。

（5）其它所有能影响ELISA等相关筛选手段的因素。这一部份详见本站有关ELISA实验的讲解与讨论。

4.  为什么我的细胞生长很慢？

答：可能的原因：

（1）使用了劣质的培养耗材、培养基、血清、HAT或HT。建议新手使用知名厂商的试剂或耗材。对于血清，可能需要从多个厂家选用多个批次试用，选择出比较好的批次进行实验。在试用血清的时候，一般可以使用相对较低浓度的血清进行骨髓瘤细胞培养实验，根据骨髓瘤细胞的倍增速度确实血清质量。

（2）使用的血清或培养基浓度不正确。仔细检查配方是否正确。

（3）制备饲养层的方法不正确。参见本页面第二个问题。

（4）其它问题，可以参考本页面第二个问题。

5.  我的克隆原来是阳性的，为什么后来转为阴性了？

答：先要注意的是，正常情况下，杂交瘤也不是绝对稳定的，确实容易发生染色体丢失的情况，尤其是当细胞移到新环境中生长，如从小孔扩大到大孔，或者复苏操作时，更容易发生阳性变为阴性。但是也有一些办法尽量减少阳性变为阴性的办法。一般可以从这几个方面加以注意：

（1）永远保证细胞处在佳的生长环境中。尤其是培养基不能长期不换，一般来说，当细胞增长到一定密度的时候，培养基就开始变颜色，这个时候就要准备换培养基了，除了换培养基，同时应该控制好细胞的密度，可以吹走过多的细胞，使新加入的培养基不至于很快被消耗。

（2）对于重要的细胞株，每一步都把阳性的细胞保种。

（3）不要过于频繁操作细胞，当细胞生长密度不是很大的时候，不要频繁操作，否则细胞容易出现死亡或者生长形态发生明显变化。

（4）对于传代次数较多的细胞株需要经常进行亚克隆，并将每一次的亚克隆株也作冻存。

（5）当细胞被支原体等微生物污染，也会发生由阳性转为阴性的情况。

6.  为什么我做亚克隆后长不出克隆来？

答：亚克隆失败的原因和克隆不长的原因类似，但是除此之外，也还有一些独特的原因。

（1）亚克隆时，原始孔里的细胞状态不好，经过有限稀释或其它手段亚克隆的细胞活性很差，以至于长不出克隆。

（2)亚克隆时，没有按照正确的数量取出细胞，在本站有关亚克隆操作的页面上提到过，亚克隆的过程服从泊松分布，如果取出的细胞远远低于平均每孔一个细胞，或有效细胞远远低于平均每孔一个细胞，则也可能出现长不出克隆的结果。

（3）未添加饲养层细胞。单个细胞在完全培养基中难培养，如果不添加饲养层细胞，则它们很可能很快就死亡，终就长不出克隆。

（4）使用的HAT中HT失效或A的浓度过高，或者未添加HT。 虽然HT对杂交瘤的生长并不是必须的，但是HT确实可以加快细胞生长，改善细胞生长状态。

（5）使用无血清培养基。这一点是很冷僻的一个因素。虽然很少有人使用无血清培养基制备单抗，但是在某些血清可能干预筛选步骤的实验的时候，可能会选用无血清培养基来培养杂交瘤，但是需要注意的是，在很多种无血清培养基中，单个细胞是很难长成克隆的。/好的解决办法就是先用含有血清的培养基培养它们，等克隆长出后再把培养基彻底更换为无血清培养基。

7.  为什么我冻存的细胞很难复苏或者复苏不活？

答：这个问题要从两个方面来回答，一是冻存方面，二是复苏问题。 对于冻存过程，需要注意：

（1）冻存液的配方。这个问题很关键，一个良好的冻存液配方可以使细胞保存得非常好，而一个不好的冻存液配方可能会让细胞倾刻死亡。目认为比较好的配方有：10%DMSO+90%胎牛血清和10%DMSO+90%养过杂交瘤的培养基，不管是哪一种，冻存保护剂DMSO的含量非常重要，如果这个浓度过低，则起不到保护作用，冻存的细胞终会死于冰晶形成时的张力，如果浓度过高，则细胞中毒而亡。如果使用第二个配方，注意一定要用养过杂交瘤的培养基，而尽量不要用一般的完全培养基，而且一定是配养需要冻存的那一株的培养基。文献中也有提到用甘油作为冻存保护剂的，站长自己没有亲自试过，不发表评论。如果新手确实对这个没把握，市场上也有商品化的冻存液，买回来按照说明书操作就OK了。

（2）冻存过程中，不可用力过大，在冻存液中重悬细胞的时候更是要轻柔，因为在DMSO存在的条件下，细胞膜变得非常脆弱，如果用力过猛，则细胞膜很容易破，复苏成活的机会就明显会下降。

（3）冻存的程序也非常重要。实践表明，以每分钟1 ℃的速度下降冻存细胞是理想的。如果条件简易，可以把细胞放在4 ℃半小时左右，然后再在-20 ℃放置1-2小时，后转入-80 ℃放置过夜，终转入液氮保存。需要短期保存的，直接放-80 ℃也行。现在市场上有比较贵的冻存盒，把需要存放的细胞放进去，然后直接放-80 ℃就行，等时间够长后直接转至液氮中即可。

（4）细胞需要保存在液氮的气相中，而不是泡在液相里。否则液氮很容易进入冻存管。这一点很多人都没有注意，大部份人都是直接往液相里放，其实这是错误的。有人认为，普通的液氮中可能含有微生物或者孢子什么的，如果放在液相中，这些微生物或孢子就有机会进入冻存管，终可能造成细胞污染。

（5）保证被冻存的细胞处于良好的生长状态，并且没有被污染。

对于复苏过程，需要注意：

（1）快速。为了防止升温中细胞内产生冰晶，强烈建议加快融化过程。一般都要用用足够体积的37 ℃热水复苏，并不断晃动冻存管。

（2）复苏过程不要把冻存管全部泡入水中，也不要把盖子弄湿，否则热水有可能污染管口，造成复苏的细胞被污染。

（3）有的人复苏细胞时，没有去掉冻存液，这样就把冻存液里的DMSO带到了新的培养体系里，容易对细胞造成毒害，因此强烈建议将融化的细胞离心后去掉冻存液，然后用新的完全培养基重悬，再接种到新的容器内培养。

8.  为什么我的细胞总是污染？如何可以救活污染的细胞？

答：养细胞出现污染，几乎是每个细胞培养技术员容易出现的问题。要防止细胞污染，无非就是保证培养环境无污染，保证所用的所有试剂都无污染源，同时提高操作时的警惕性，这些基本的知识这里就不再废话了。