一、目的

 

(1)了解PCR产物电泳与纯化的原理。

 

(2)熟悉和掌握PCR产物电泳与纯化的操作。

 

二、原理

 

在PCR过程中，部分引物和dNTPs在Taq酶等因子的作用下以DNA模板为指导合成新的DNA分子，当然还有一部分的引物和dNTPs没有完成所期望的任务,以小分子的形式存在于PCR产物混合液中,为了后续分子克隆的工作能够顺利进行,PCR产物就需要进行纯化，以去除PCR产物混合液中残留的Taq酶、BSA、Mgt+、引物dNTPs.buffer中的小分子以及非特异性扩增产物。

 

通过电泳将所需要的PCR产物和其他分子分离,经过EB染色后，在紫外灯激发显色下把目标条带从凝胶中切出来，然后通过相应的缓冲液将其溶解，经异丙醇(乙醇)作用使得DNA分子沉淀，再通过在高速离心让沉淀的DNA分子结(indin)在滤膜上，而后用洗脱缓冲eluton ut其从滤膜上洗脱下来就得到了纯化的PCR产物。

 

三、买验材料、器材和试剂1.实验材料

 

有目标条带的PCR扩增产物。

 

2.实验器材

 

①离心机;②2mL离心管;③移液器;④移液枪头;⑤水浴锅;⑥手术刀片;⑦紫外凝胶观察仪;⑧密封盒;⑨防紫外线眼镜;?橡胶手套;①分析天平;2离心管架;③1.5mL离心管;④水平电泳槽;⑤电泳仪;①⑥微波炉;⑦蓝盖试剂瓶;⑧带有层析滤膜的离心管(QIA quickspincolumn)。

 

3.实验试剂

 

①PCR产物纯化试剂盒(QIAGEN);②异丙醇;③琼脂糖;④6X上样缓冲液(loading-buffer) ;⑤1X TAE电泳缓冲液;⑥溴化乙锭(EB) ;⑦100bp DNA marker;⑧3M NaAc(pH值为5. 0)。

 

四、操作方法

 

(-)琼脂糖凝胶电泳

 

1.制胶

 

准制脑胶模具，称取128脂期，倒人蓝盖试剂瓶中，然后用量简量取50mL 1x

 

TAE电泳缓冲液倒人蓝盖瓶中。盖紧瓶盖，放人微波炉中，中火2~3min,待琼脂糖完全熔化后,取出蓝盖试剂瓶(取时要戴微波炉手套,以免被烫伤)，于室温下放置5~8min,将凝胶液缓缓倒入制胶模具中,插上样品梳，于室温下静置20~ 30min。

 

2.点样

 

将凝固好的琼脂糖凝胶,放人加有电泳缓冲液的水平电泳槽中，取出样品梳。然后加人15pL有目标条带的PCR扩增产物+1.5pL 6X.上样缓冲液(Loading buffer)的比例进行混合后,把混合溶液加人凝胶的样品槽中,在合适的样品槽中加人2μL100bpDNAmarker.

 

3.电泳

 

盖好电泳槽盖后，接通电源，120V电泳1h 20min左右(在凝胶中只有一排样品槽的情况)。

 

4.凝胶染色

 

电泳完毕后,取出凝胶,放人装有溴化乙锭的密封盒中，染色25min。

 

(二)电泳后PCR产物纯化

 

找出电泳结果出现单一目标条带的对应PCR扩增产物进行纯化。具体步骤如下:(1)在2.0mL的离心管壁上写上准备纯化的PCR产物的相关信息,并称重。

 

(2)切下含目标片段的胶块，切得尽可能小一些,把所得的胶块放人2.0mL的离心管中。

 

(3)称量装有胶块的离心管重量，计算出胶块的重量。

 

(4)加入6倍体积的QG buffer到离心管中(100mg胶相当于100pL)。

 

(5)将含有胶块的离心管放人50°C水浴锅中，温育10min,至胶块完全溶解，为促进溶解，每2~ 3min振荡离心管-一次。

 

(6)胶块全部溶解后,检查混合液的颜色是否为黄色(与未溶解之的QG buffer 的颜色相似,若混合液的颜色为橙色或紫色,加10pL 3M NaAc(pH值为5. 0)。

 

(7)向离心管中加人1倍凝胶体积的异丙醇,混匀。

 

(8)将溶液转移人QIA quick spin column中,13 000rpm离心1min。

 

(9)弃掉液体,加入750μL PE buffer ，静置2~5min,13 000rpm离心.1min.

 

(10)弃掉液体,13000rpm离心1min(空载离心，除去乙醇)。

 

(11)把QIA quick spin column置于一一个洁净的1. 5mL的离心管中。

 

(12)加人30pL的elution buffer置膜中央,13000rpm离心1min。(13)将洗脱所得溶液置于一20°C中储存。

 

所得到的洗脱液可与克隆载体进行连接，然后转化使重组DNA分子进人大肠杆菌细胞内,经过培养获取克隆子。