冻存原理

当细胞所处温度低于0°C时，细胞脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶，冰晶的大小对细胞的影响是不同的，大冰晶容易造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂，故造成复苏出来的细胞存活率、状态等与冻存的状态相差甚远。因此，我们在冻存细胞的时候会采取两个措施，一加入低温保护剂，二，慢冻细胞

冻存时机：细胞应在生长良好、密度约为 80-90％、数目一般为 10 6 -10 7 /ml，活力差的细胞在冻存后的成活率很小。

低温保护剂：常用的低温保护剂是二甲基亚砜DMSO，它是一种渗透保护剂，可迅速透入细胞，提高细胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。

慢冻细胞：可以使用程序性降温盒，缓慢冻存细胞，可使细胞内避免产生大的冰晶。如果没有程序降温盒，可以将冻存细胞依次放于4度1h，-20度2h，-80过夜，大部分细胞也可以适应。

冻存液配置：冻存液应该提配制，置于室温备用，防止临时配制产生的热量损伤细胞（DMSO加入到培养基中会放热），冻存液常规配比为培养基：血清：DMSO=7:2:1，如果细胞比较珍贵，可以调整为血清：DMSO=9:1。

　　操作步骤：

1.用移液器吸走原培养基，加入适量PBS洗1-2遍；

2.消化细胞：加入适量胰酶，置于培养箱中37°C消化（10厘米大皿中加入1ml 0.25%的胰酶，消化4-5min，注意不同细胞消化时间不同，终止消化截点为镜下观察80%-90%以上的细胞变圆）；

3.待消化到位后加入胰酶2倍体积的完全培养基终止消化，800-1000rpm离心3-5min；

4.准备好冻存管，标记上日期，细胞类别，人名，代数，待细胞离心后去上清，加入冻存液重悬，每管1-1.5ml,转移到冻存管中；

5.将冻存管放入程序降温盒中，-80度过夜，然后转移到液氮中保存。
　　
　　注意事项

1、  细胞加入冻存液之后立即放入-80度保存，勿常温放置太久

2、 冻存细胞储存在-80度中通常不建议超过半年，液氮中通常不建议超过2年。