本试剂盒运用双抗体夹心ELISA法定量测定犬血清、血浆、组织匀浆、细胞裂解液、细胞培养上清液和其他生物液体中犬巨噬细胞炎性蛋白1β(MIP1β)含量。

实验原理

本酶联免疫吸附测定ELISA试剂盒运用采用双抗体夹心ELISA法。用抗犬巨噬细胞炎性蛋白1β(MIP1β)抗体包被于酶标板上，实验时样品或标准品中的犬巨噬细胞炎性蛋白1β(MIP1β)与包被抗体结合，游离的成分被洗去。依次加入生物素化的抗犬巨噬细胞炎性蛋白1β(MIP1β)抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素。抗犬巨噬细胞炎性蛋白1β(MIP1β)抗体与结合在包被抗体上的犬巨噬细胞炎性蛋白1β(MIP1β)结合、生物素与亲和素特异性结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物(TMB)，TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加终止液后变成黄色。用酶标仪在450nm波长处测OD值，犬巨噬细胞炎性蛋白1β(MIP1β)浓度与OD450值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出样品中犬巨噬细胞炎性蛋白1β(MIP1β)的浓度。具体参照各指标试剂盒相应的使用说明书。

试剂盒内容

自备设备与试剂

1.         450±10nm滤光片的酶标仪(建议仪器使用提预热)

2.         单道或多道微量加液器及吸头

3.         稀释样品的EP管

4.         蒸馏水或去离子水

5.         吸水纸

6.         盛放洗液的容器

储存与有效期

1.         未开封的试剂盒：所有试剂均按试剂瓶标签上所示保存。请注意，收到试剂盒后请尽快将TMB 洗涤液，终止液保存于4℃，其他试剂保存于-20℃。

2.         使用后的试剂盒：剩余试剂仍需按照试剂瓶标签所示的温度保存，开封后的酶标板要加干燥剂后密封保存于-20℃，避免潮湿。

注意：

试剂盒内酶标条可拆卸，按实验需求可分多次使用；使用后的剩余试剂盒建议在次实验后 1个月内使用完毕。产品过期时间以盒子上的标签为准，保质期内所有组分都确保是稳定的。

采集与保存

1.血清：

将收集于血清分离管的全血标本在室温放置 2 小时或 4oC 过夜，然后 1000×g 离心 20 分钟，取上清即可，或将上清置于-20oC 或-80oC 保存，但应避免反复冻融。

2.血浆：

用 EDTA 或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的 30 分钟内于 2-8oC 1000×g 离心 15 分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20oC或-80oC 保存，但应避免反复冻融。

3. 组织匀浆：

1） 取适量组织块，于预冷PBS（0.01mol/L, pH 7.0-7.2）中清洗去除血液，称重后备用（组织块较大需先剪碎后再匀浆）；

2） 可同时选用多种匀浆方法达到较好的破碎效果：先将组织块移入玻璃匀浆器，加入5-10mL 预冷PBS 进行充分研磨，该过程需在冰上进行（有条件实验室可选用机器匀浆）；得到的匀浆液可再利用超声破碎或反复冻融 进一步处理（超声破碎过程中注意冰浴降温；反复冻融法可重复2次）。

3） 将制备好的匀浆液于5000×g 离心5 分钟，留取上清即可检测。

4. 细胞裂解液：

1）贴壁细胞需要先用胰酶消化，离心收集细胞（悬浮细胞可直接离心收集）；

2）将收集到的细胞用冷PBS 洗3 次；

3）物理方法裂解细胞（可先超声破碎细胞，再反复冻融）：

i 超声破碎：取适量PBS 重悬细胞，用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂。

ii 反复冻融：将待破碎的细胞在-20 oC 以下冰冻，室温融解，反复3 次，使细胞溶胀破碎。

4）将标本于2-8 oC 1500×g 离心10 分钟，收集上清备用。

5. 细胞培养上清或其它生物标本：

请 1000×g 离心 20 分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20oC 或-80oC 保存，但应避免反复冻融。

注意：

1.以上标本均需密封保存，4oC保存应小于1周，-20oC不应超过1个月，-80oC不应超过2个月。

2.标本使用应缓慢均衡至室温，不应加热使之融解。

3.实验红细胞裂解液必须用标准品稀释液稀释。

试剂准备

1.使用将所有的试剂和标本缓慢均衡至室温(18-25oC)，试剂不能直接在37oC溶解。

2.标准品(冻干品)：每瓶标准品加入标准品稀释液1mL，盖好后室温静置大约10分钟，同时反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为2000pg/mL。准备7个稀释标准品的EP管，每个EP管中加入150μL的标准品稀释液，如图依次倍比稀释成不同的梯度，2000pg/mL-1000pg/mL-500pg/mL-250pg/mL-125pg/mL-62.5pg/mL, 标准品稀释液(0pg/mL)直接作为空白孔。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。 

3.浓洗涤液：用580mL蒸馏水或去离子水将20mL浓洗涤液稀释至600mL，进行30倍稀释。

标本处理

1.本公司只对试剂盒本身负责，不对因使用该试剂盒所造成的样本消耗负责，请使用者使用充分考虑到样本的可能使用量，预留充足的样本。

2.实验应预测标本含量，如果标本浓度过高，应对标本进行稀释，使稀释后的标本符合试剂盒的检测范围，计算时再乘以相应的稀释倍数。