链cDNA合成的起始可以使用三种不同的方法，各种方法的相对特异性影响了所合成cDNA的量和种类。

      随机引物法是三种方法中特异性zui低的。引物在整个转录本的多个位点退火，产生短的，部分长度的cDNA。这种方法经常用于获取5＇末端序列及从带有二级结构区域或带有逆转录酶不能复制的终止位点的RNA模板获得cDNA。为了获得zui长的cDNA，需要按经验确定每个RNA样品中引物与RNA的比例。随机引物的起始浓度范围为50到250ng每20μl反应体系。因为使用随机引物从总RNA合成的cDNA主要是核糖体RNA，所以模板一般选用 poly(A)+RNA。

      Oligo(dT)起始比随机引物特异性高。它同大多数真核细胞mRNA 3＇端所发现的poly(A)尾杂交。因为poly(A)+RNA大概占总RNA的1%到2％，所以与使用随机引物相比，cDNA的数量和复杂度要少得多。因为其较高的特异性，oligo(dT)一般不需要对RNA和引物的比例及poly(A)+选择进行优化。建议每20μl反应体系使用0.5μg oligo(dT)。oligo(dT)12-18适用于多数RT-PCR。ThermoScript RT-PCR System提供了oligo(dT)20，因为其热稳定性较好，适用于较高的保温温度。

      基因特异性引物（GSP）对于逆转录步骤是特异性zui好的引物。GSP是反义寡聚核苷，可以特异性地同RNA目的序列杂交，而不象随机引物或 oligo(dT)那样同所有RNA退火。用于设计PCR引物的规则同样适用于逆转录反应GSP的设计。GSP可以同与mRNA3＇zui末端退火的扩增引物序列相同，或GSP可以设计为与反向扩增引物的下游退火。对于部分扩增对象，为了成功进行RT-PCR，需要设计多于一个反义引物，因为目的RNA的二级结构可能会阻止引物结合。建议在20μl的*链合成反应体系中使用1pmol反义GSP。

      为了将扩增的cDNA同沾染的基因组DNA扩增产物分开，可以设计分别同分开的外显子退火的引物。来源于cDNA的PCR产物会比来源于沾染的基因组 DNA的产物短。另外对每个RNA模板进行一个无逆转录的对照实验，以确定一个给定片段是来自基因组DNA还是cDNA。在无逆转录时所得到的PCR产物来源于基因组。

 抑癌蛋白DKK3IgG大鼠S100B蛋白(S-100B)
 抑癌蛋白EZH2IgG大鼠P选择素(P-Selectin/CD62P)
 抑癌基因CSMD1IgG大鼠P物质受体(SP-R)
 抑癌基因IgG大鼠P物质(SP)
 抑癌基因NDRG2IgG大鼠P53(P53)
 抑癌基因NDRG3IgG大鼠N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸(AcSDKP)
 抑癌基因NDRG4IgG大鼠N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)
 抑癌基因p14IgG大鼠N端前脑钠素(NT-proBNP)
 抑癌基因SNF2βIgG大鼠L选择素(L-Selectin/CD62L)
 抑制素/肿瘤抑制因子IgG大鼠L-鼠乳酸脱氢酶(L-LDH)
 

原创作者：上海谷研实业有限公司