胰酶消化的程度是一个关键:消化过度则对干细胞的活性损伤较大,并有部分干细胞漂浮,随弃去的胰酶流失;消化不足则干细胞难于从瓶壁上吹下,反复吹打同样也会损伤干细胞活性。 影响消化速度的因素较多,主要有胰酶溶液的活性(配制条件、冻存或4℃保存时间长短、是否反复冻融、化冻后存放时间及温度等)、消化时的温度(气温、细胞培养瓶及胰酶溶液的温度)以及所加胰酶溶液的多少等 。
贴壁细胞的消化 :
常用的bai消化du方法主要有酶消化法、离子螯合剂、zhi物理法和冷冻法。其中*常用的是酶消化法。
1、 酶消化法
贴壁干细胞酶消化传代时通常采用两种方式:1)、加入胰酶等干细胞脱落后,再加培养基中止胰酶作用,离心传代;2)、加入胰酶后,镜下观察待干细胞开始脱落时,弃去胰酶,加入培养液并分瓶。但前者太麻烦,而后者有可能对干细胞施加胰酶选择,因为总是贴壁不牢的干细胞先脱落。
常用的消化酶有:
1)、胰酶 这是用得*多的。一般浓度在0.25-0.5%。作用时间根据干细胞种类、作用温度等因素而变化很大,从几分钟到几十分钟不等。0.25%的胰酶作用于单层贴壁的干细胞,在37度条件下,一般消化1-5分钟就足够了。终止是用血清。主要作用于干细胞间。配制时不能用含钙、镁的平衡液,否则影响活性。保存于-20度。
2)、胶原酶 这种方法比较少,一般是用原代培养时,从组织消化下干细胞。这种方法作用温和,对干细胞损伤较小,但是,价格也较贵。中止同样是用血清。
胰酶的质量是影响干细胞的消化的关键因素,如果配的比较标准,消化的时候就容易消化,反之就不易消化。还要在你看到消化过头的情况下,如果干细胞下来的比较多了,这时可以连同CMF或PBS加上营养液一起传。营养液中有血清,胰酶遇到血清就会自动终止消化,但这样操作对干细胞是有一定的影响的。
对于容易消化的干细胞,加入PBS缓冲液洗去血清或加入胰酶,先中和血清的作用(30s),弃之,再加入适量胰酶作用10s-40s(根据细胞消化的难易程度),弃之,这样依赖残余的胰酶就可将干细胞消化单细胞。
在此介绍一种简单省事并且效果好、不损失干细胞的方法:倒掉旧培养液,加入少量胰酶冲洗一下,倒掉,再加入0.125-0.25%胰酶约6-10滴或1ml(25ml bottle)消化,再加入适量新培养基中和并分瓶。