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人miRNA上游引物
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详细内容
1.CTAB 溶液在低于15℃时会析出沉淀,因此在将其加入冷冻的植物材料中之必须预热。
2.在适条件下,DNA—CTAB 沉淀呈白色纤维状,很容易一下子就从溶液中钩出。不过,某些植物种的DNA 沉淀中可能含有杂质,特别是多糖,使DNA 沉淀呈絮状或胶状,这种情况下可能需要稍事离心才能得到DNA. —CTAB 沉淀。
3.饱和酚虽然可有效地使蛋白质变性,但酚不能完全抑制RNA 酶的活性,而且酚可以溶解含poLy(A)的mRNA。如果用*和的混合液,可减轻这两种现象,同时可加入适量的异戊醇(*—异戊醇=25:24:1),异戊醇的作用是消泡,并使蛋白质层紧密,使水相和有机相分层较好。 细菌的培养和收集 将含有质粒pBS 的DH5α菌种接种在LB 固体培养基(含50μg/ml Amp)中, 37℃培养12-24 小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB 液体培养基(含50μg/ml Amp)中,37℃振荡培养约12 小时至对数生长后期。小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒DNA 十分有用。这些方法共同特点是简便、快速,能同时处理大量试样,所得DNA 有一定纯度,可满足限制酶切割、电泳分析的需要。
产品属性:
中文名称:人miRNA上游引物
英文名称:Human miRNA Forward Primer
产品规格:50μl体系×300次
产品货号:GOY-F10560
microRNAs(miRNAs)是一类由18~25核苷酸组成的非编码单链小分子RNA,具有表达的时序性、序列严格的保守性、组织器官表达量的相对特异性等特点,在细胞分化,生物发育及疾病发生发展过程中发挥巨大作用。 随着miRNA相关研究在迅速增加,为了方便客户,我们推出了miRNA引物系列产品。该引物数据库中为miRNA荧光定量检测的上游引物;所有引物库中的引物已经过验证。验证样本miRNA mimics,经过我司miRNA cDNA第yi链合成试剂盒(WH0131)合成cDNA后,配合我司miRNA荧光定量检测试剂盒(WH0132)及试剂盒中的下游引物进行荧光定量验证。 使用方法: 本品为粉末状引物干粉,请根据说明书中标注的分子量使用RNA-free ddH2O进行溶解,配置成100μM的储存液,工作液浓度为10 μM。 建议开盖先短暂离心,轻启管盖,以免粉末损失。 溶解后的引物建议分装后保存,以免在操作中出现污染和反复冻融造成的不利影响。 溶解后的引物请在-20度冰箱中保存。 本试剂盒采用SYBR Green I嵌合荧光法的原理进行miRNA荧光定量检测。本试剂盒中的2×miRNA PreMix是门为miRNA定量检测而研发的新一代预混形式的荧光定量PCR检测试剂,其中的DNA聚合酶采用的是化学修饰的热启动形式,配合特殊的Buffer体系,使反应特异性更好,灵敏度更高,并能在更广的范围内进行准确定量。 试剂盒特点: 灵敏度高:可在pg的总RNA中检测到目的miRNA。 特异性:体系全新升,更好的区分单碱基的差异,区分家族中的不同miRNA。 通用性好:适用于各种类型的荧光定量PCR仪。 |
1.根据要保存的各样本的体积,计算出所需RNAwait用量。RNAwait的用量应当是组织体积的10倍(如100mg组织约用1ml RNAwait);离心收集2×106细胞RNAwait的用量是1ml。
2. 将RNAwait按需要量分装入自备保存管中;
3. 快速将较大的组织切成厚度<0.5 cm的任意片状,立即完全浸入RNAwait中。组织的厚度一定要<0.5 cm。组织过厚则RNAwait不能有效渗入,组织中间部位的RNA不能受到保护。较小的组织(如大鼠的肾脏、脾脏,小鼠的大部分器官)取下后可以直接浸入RNAwait。
4. 保存时先将样本浸入RNAwait后置4℃冰箱过夜(4℃过夜是必需的,这样可使RNAwait完全渗入到组织中),然后转移到-20℃冰箱(RNAwait在-20℃时仍为液态,有结晶析出,是正常情况);或者在4℃冰箱过夜后,从RNAwait中取出组织块,转移到-80℃冰箱。在RNAwait中保存的标本,反复冻融至室温20次不影响RNA的质量。
注意事项:
1) 由于细胞凋亡是一个快速的过程,建议样品在染色后1小时之内进行分析。
2) 对于贴壁细胞,消化是一个关键步骤。贴壁细胞诱导细胞凋亡时如有漂浮细胞,需收集漂浮细胞和贴壁细胞后合并染色。处理贴壁细胞时要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。*消化时间过短,细胞需要用力吹打才能脱落,容易造成细胞膜的损伤,PI摄入过多;消化时间过长,细胞膜同样易造成损伤,甚至会
影响细胞膜上磷脂酰*与Annexin V-FITC的结合。消化时将*铺满孔板底后,轻摇时*与细胞充分接触,然后倒掉大部分*,利用剩余的少量*再消化一段时间,待细胞间空隙增大,瓶底呈花斑状即可终止。在消化液中尽量不用EDTA,EDTA会影响Annexin V与PS的结合。
3) 实验中如需要固定细胞,比如在检测凋亡的同时检测细胞周期,只能选用Annexin V-FITC,而不能选用Annexin V-EGFP,因为在固定过程中EGFP会变性导致丧失激发荧光的能力。固定需要先将细胞与Annexin V-FITC进行孵育,并用binding buffer洗掉未结合的Annexin V-FITC。因为固定过程中细胞通透性增加会产生细胞碎片,可以和Annexin V结合,对结果产生干扰。
4) 如果样品来源于血液,请务必除去血液中的血小板。因为血小板含有PS,能与Annexin V结合,从而干扰实验结果。可以使用含有EDTA的缓冲剂并在200 g离心洗去血小板。
5) 试剂在开盖请短暂离心,将盖内壁上的液体甩至管底,避免开盖时液体洒落。
6) Annexin V-FITC和PI是光敏物质,在操作时请注意避光。
真菌/酵母细胞细胞壁分离试剂盒20次V-P半固体琼脂人β萘(β-Nph)ELISA试剂盒,
人miRNA上游引物16-Oxolyclanitin-29-yl p-coumarate
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