测定步骤：

1、 分光光度计预热30min以上，调节波长至450nm，蒸馏水调零。

2、 试剂三的稀释：将试剂三用蒸馏水稀释50倍，用多少配多少。（试剂三和蒸馏水1：49稀释。

3、 工作液配制：在试剂一加入250μl试剂二，充分混匀。配好的试剂4℃避光可保存一周。（若一次性测定样本较少，可按照实际用量将试剂一和试剂二按照20ml：0.1ml的比例混匀配制）

4、 将一瓶试剂四用5ml蒸馏水溶解（溶解后一周内用完）。

5、 样本测定充分混匀，室温静置30min后，450nm处测定各管吸光值A。

注意事项：

待测样品-70℃可保存1个月。需注意反复冻融会导致SOD部分失活。

一个试剂盒如果不能在3次内使用完毕，其中的WST-8需要在次使用时适当分装，以避免反复冻融导致的检测效果下降。

标准品稀释时所用的稀释液应尽量与样品一致。样品用试剂盒提供的SOD样品制备液制备时，标准品也宜使用SOD样品制备液进行稀释；当样品为血液等无需处理的样品时，宜使用试剂盒提供的SOD检测缓冲液稀释标准品。

抗氧化物会对本试剂盒的检测产生干扰，例如0.1mM ascorbic acid，5mM GSH都会使测定出来的吸光度显著升高。此时尽管样品没有颜色，如果设置了使用说明中的空白对照3，就可以消除样品中的抗氧化物的干扰。

分光光度计、离心机、移液器、1ml玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水

SOD酶活力的计算：

使用说明：

样品的准备：

细胞样品的准备：对于贴壁细胞，吸净细胞培养液，用4℃或冰浴预冷的PBS或生理盐水洗涤一遍，按照每100万细胞加入100～200μL的比例加入本试剂盒提供的SOD样品制备液，适当吹打以充分裂解细胞；对于悬浮细胞，600g离心5分钟收集细胞，用4℃或冰浴预冷的PBS或生理盐水洗涤一遍，按照每100万细胞加入100～200μL的比例加入SOD样品制备液，适当吹打，以充分裂解细胞。4℃约12000g离心3～5分钟，取上清作为待测样品。

组织样品的准备：动物用生理盐水(0.9% NaCl，含有0.16mg/ml肝素钠)灌流清除血液后获取组织样品。取适量的组织样品，按照每10mg组织加入100μL SOD样品制备液的比例在4℃或冰浴进行匀浆(可以使用玻璃匀浆器或各类常见电动匀浆器)。4℃约12000g离心3～5分钟，取上清作为待测样品。

血浆或红细胞样品的准备：用抗凝管收集血液，颠倒混匀。4℃ 600g离心10分钟，移取上清至另一新的1mL离心管中，适量生理盐水稀释后即可作为血浆样本进行检测。红细胞样品可以参考步骤1a悬浮细胞样品的制备方法，或其它不含Triton X-100等去垢剂的样品制备方法。

上述样品准备完毕后可以用百奥莱博生产的BCA蛋白浓度测定试剂盒(货号：YT036/YT037)测定蛋白浓度。通常10～20μg蛋白的细胞或组织匀浆液样品中的SOD平均活力约1个活力单位左右(不同细胞和组织的差异会比较大，该活力范围仅作为初步的参考)。每种样品准备20～100μg蛋白量通常已经足够用于后续检测。

根据蛋白浓度和预计的蛋白使用量，用本试剂盒提供的SOD检测缓冲液适当稀释样品。例如，小鼠肝脏组织10%匀浆液(组织和匀浆液的重量比为1:10)上清，通常需要稀释10～100倍。准备好的样品如果当天测定，可以冰浴保存；如果当天不能完成测定，可以-70℃冻存，但建议尽量当天完成测定。

试剂盒的准备工作：

WST-8/酶工作液的配制：按照每个反应160μL的体积配制适量的WST-8/酶工作液。均匀混合151μL SOD检测缓冲液、8μL WST-8和1μL酶溶液，即可配制成160μL WST-8/酶工作液。根据待检测样品(包括标准品)的数量，配制适量的WST-8/酶工作液。具体配制方法可以参考下表。配制好的WST-8/酶工作液4℃或冰浴保存，可以在当天使用，但建议尽量现配现用。