1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞,每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml,用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定,不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
c.细胞悬液 离心收集细胞,每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol,反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。
3.可选步骤:如样品中含有较多蛋白质,脂肪,多糖或胞外物质(肌肉,植物结节部分等)可于2-8℃10000×g离心10分钟,取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2m,剧烈振荡15秒,室温放置3分钟。
6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
7. 把水相转移到新管中,如要分离DNA和蛋白质可保留有机相,进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇,室温放置10分钟。
8. 2-8℃10000×g离心10分钟,离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。
9. 用75℅乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。2-8℃不超过7500×g离心5分钟,弃上清。
10.室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀,大约晾5-10分钟即可.不要真空离心干燥,过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。加入25-200μl无RNase的水或0.5℅SDS,用枪头吸打几次,55-60℃放置10分钟使RNA溶解.如RNA用于酶切反应,勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅的去离子甲酰胺溶解,-70℃保存。
shgoy-1935异佛尔酮2,3-Butanediol
shgoy-1936鱼藤酮BT
shgoy-1937肾上腺酮NPG
shgoy-1938酚试剂DPG
shgoy-1939交链聚乙烯吡咯烷酮Dodecanol
shgoy-1940聚乙烯吡咯烷酮1,2,6-Hexanetriol
shgoy-19411,3-二羟基丙酮1-Hexanol
shgoy-19424-氨基安替比林PPG
shgoy-1943苯乙酮Glutaraldehyde
shgoy-19443-氨基苯乙酮Paraformaldehyde
shgoy-19454-氨基苯乙酮TCA
shgoy-1946亚苄基丙酮Benzaldehyde
shgoy-1947苯并蒽酮OCBA
shgoy-1948苯甲酰三氟丙酮Citral
shgoy-1949苄丙酮2,4-DCAD
shgoy-1950双吡唑酮3,4-Dichlorobenzaldehyde
shgoy-1951环辛酮3,4-Dihydroxybenzaldehyde
shgoy-19522-癸酮Dimedone
shgoy-1953二苯甲酮2,4-Dimethoxybenzaldehyde
shgoy-19549-芴酮3-Fluorobenzaldehyde
shgoy-19552-氟苯乙酮4-Fluorobenzaldehyde
shgoy-1956α-紫罗酮PHBA
shgoy-19574-甲氧基苯乙酮4-Methoxybenzaldehyde
shgoy-19581-甲基-2-吡咯烷酮2-Nitrobenzaldehyde
phospho-LRP5(Thr1492)磷酸化低密度脂蛋白受体相关蛋白5抗体
phospho-LRP1(Ser4523)磷酸化低密度脂蛋白受体相关蛋白1抗体
LKB1苏氨酸蛋白激酶LKB1抗体
LMP7低分子量蛋白7抗体
LIM protein脂肪瘤相关蛋白抗体
Laminin subunit beta-4层粘连蛋白β4抗体
GnRH-associated peptide I黄体激素释放激素/促性腺激素释放激素抗体
LOX蛋白赖氨酸-6-氧化酶抗体
LTK白细胞酪氨酸激酶受体抗体
LMX1A同源盒转录因子LMX1A抗体
cDNA 链合成试剂盒10 次包装LTBP1转化生长因子β1结合蛋白1抗体
Manic Fringe狂躁基因同源蛋白MFNG抗体
Mib1E3泛素蛋白连接酶MIB1抗体
MAML1主导控制样蛋白1抗体
MAML2主导控制样蛋白2抗体
MAPK6丝裂原活化蛋白激酶6抗体
phospho-MST4 + MST3 + STK25 (Thr178 + Thr190 + Thr174)磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶MST4,MST3,STK25抗体
MEGF10表皮生长因子样蛋白Megf10抗体
MPP4MPP4蛋白抗体
MCM7/CDC47微小染色体维持缺陷蛋白7抗体
MUL1E3泛素连接酶MUL1抗体
MAGP2纤微丝相关糖蛋白2抗体
Mast Cell Chymase肥大细胞类糜蛋白酶1抗体
Metronidazole(1C2)甲硝唑单克隆抗体
MrpL12线粒体核糖体蛋白L12抗体
cDNA 链合成试剂盒10 次包装技术优势
1. 能有效的处理土壤样品中一些很难处理的组分如: 真细菌孢子(eubacterial spores)、内芽孢(endospores)、格兰仕阳性菌(gram positive bacteria)、酵母(yeast)、线虫(nematodes)、海藻(algea)、真菌(fungi)等。
2. 样品处理过程中使用的 MT Buffer和Sodium Phosphate Buffer可在整个提取过程中有效的保护核酸,并大限度的降低RNA污染。
3. 基于硅珠的纯化方法,可有效地去除腐植酸、多元酚等PCR抑制物
4. 纯化所得的DNA可直接用于PCR、酶切等后续实验之中。
5. 对腐植酸含量特别高的样品,附加额外的处理方法。