4. PCR mix 中含上样染料,PCR 后可以直接上样电泳。
以参照物为标准,对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测,从而达到评估样本中靶基因的拷贝数,称为定量PCR。定量PCR的可行性定量一般是在PCR扩增的指数期进行的。
理想的扩增结果:Y=X×2n 其中Y代表扩增产物量, X代表PCR反应体中的原始模板数 n为扩增次数;理论上PCR扩增效率为100%,PCR产物随着循环的进行成指数增长,但实际上:DNA的每一次复制都不完全,即每一次扩增中,模板不是呈2的倍增长;实际应为:Y= X(1+E)n ,其中E 代表扩增效率:E = 参与复制的模板/总模板,通常E≤1,E在整个PCR扩增过程中不是固定不变的。通常X 在 1~105拷贝、循环次数n≤30时,E 相对稳定,原始模板以相对固定的指数形式增加,适合定量分析,这也就是所谓的指数期;随着循环次数n的增加(>30次),E值逐渐减少,Y 呈非固定的指数形式增加,*后进入平台期。
PCR是对原始待测模板核酸的一个扩增过程,任何干扰PCR指数扩增的因素都会影响扩增产物的量,使得PCR扩增终产物的数量与原始模板数量之间没有一个固定的比例关系,通过检测扩增终产物很难对原始模板进行准确定量。近年来研究人员通过大量的实践,研究了相对准确的定量PCR方法,即荧光定量PCR。
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