-20℃

产品组成

产品简介

基于重组原理的无缝克隆技术，作为新一代的克隆方法，不依赖繁琐的酶切、连接步骤，也不需要末端补平等操作，依据DNA 片段与线性化载体末端的15~25 nt 同源序列的重组，可将插入片段克隆至任意线性载体的任意位点，载体自连背景低，是一种简单、快速、高效的DNA 定向克隆技术。

Fast One Step Cloning Kit 无缝克隆试剂盒，一次反应可完成单至多个DNA 片段的重组，快仅需5 分钟即可完成单片段重组，且阳性率高于95%。Kit 中添加的辅助因子，有效提高克隆阳性率；经优化的反应体系，能够一定程度上耐受未纯化PCR 产物中含有的杂质。升版的无缝克隆试剂盒具有更高的阳性率、更好的兼容性。

实验步骤

1. 实验流程概要

2. 线性化克隆载体制备

选择合适的克隆位点，对载体进行线性化，载体的线性化可以通过酶切或反向PCR 扩增完成。

① 酶切制备

一些限制性内切酶不能有效地消化超螺旋DNA，因此可能会留下不同数量的未切割载体DNA，降低阳性率。推荐使用LightNingTM 快速内切酶进行酶切（单酶切或者双酶切），使载体线性化完全，以降低转化背景（未切割的载体转化获得的假阳性克隆）。

注1：经酶切进行线性化的载体无需去磷酸化，推荐使用双酶切。

注2：酶切完成后，建议将内切酶失活或对目的产物纯化后用于重组反应。

② 反向PCR 扩增制备

为减少扩增突变的引入，推荐使用高保真PCR Mix 进行扩增。推荐使用预线性化质粒作为模板，以减少环状质粒模板残留对克隆阳性率的影响。

注1：PCR 产物无非特异性条带时， 推荐使用Template Eliminator（ 货号：EG21203）消化质粒模板即可用于重组反应；反之建议将PCR 产物纯化后使用。

注2：多片段克隆时，建议将PCR 产物纯化后使用。

3. 插入片段PCR 引物设计

PCR 引物的5＇ 端必须包含与其相邻片段（插入片段或载体）末端同源的15~25 nt（推荐18 nt）序列。假如载体为粘性末端，且3＇ 端突出，则引物设计必须包含突出部分；若5＇ 端突出，则引物设计可以包含突出部分，也可以不包含。

插入片段正向扩增引物：

5＇—上游载体末端同源序列+ 酶切位点（可选）+ 基因特异性正向扩增序列— 3＇

插入片段反向扩增引物：

3＇—基因特异性反向扩增序列+ 酶切位点（可选）+ 下游载体末端同源序列—5＇

注1：尽量选择无重复序列且 GC 含量均匀的区域进行克隆，当载体克隆位点上下游25 nt 区域内 GC 含量为40%~60% 时，重组效率高；

注2：本试剂盒所提供的pUC 19 载体（Ampr）连接端序列如下：

4. 插入片段的PCR 扩增

推荐使用高保真PCR Mix 进行扩增，以减少扩增突变的引入。建议使用纯化后的PCR 产物进行无缝克隆反应，若PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定为特异性扩增产物，可直接使用，但加样体积不应超过总反应体积的20%。

5. 重组反应

① 于冰水浴中配置以下反应体系：

a. 适载体用量(ng) = 0.02 × 载体碱基对数，即0.03 pmol。

b. 插入单片段，适片段用量（ng）= 0.04 × 片段碱基对数；插入多片段，每片段适用量（ng）= 0.02 × 片段碱基对数。

注1：若插入单片段的长度大于载体，则应互换载体与插入片段用量；

注2：若插入片段的长度小于200 bp，则插入片段应使用5 倍载体用量；

注3：若按上述公式计算得到的用量超过低/ 高值，则建议直接按低/ 高用量使用；

注4：载体片段过长、插入片段过长或片段数过多，克隆阳性率均会降低。

重组反应体系配制完成后，用移液枪轻轻吸打混匀各组分，避免产生气泡，切勿涡旋。

② 将反应体系置于50℃，反应5~60 min。

注1：推荐使用 PCR 仪等温控比较精准的仪器进行反应，反应时间不足或太长克隆效率均会降低；

注2：插入1~2 个片段时，推荐反应时间为5~15 min；插入3~5 个片段时，推荐反应时间为15~30 min；

注3：当载体骨架在10 kb 以上或插入片段在4 kb 以上时，建议延长反应时间到30~60 min；

注4：50℃反应完成后，建议进行瞬时离心，将反应液收集至管底。

③ 将反应液离心管置于冰上冷却，之后进行转化或者储存于 -20℃。

注 1： -20℃储存的重组产物，建议在 1 周内使用。

6. 重组产物转化

取5~10 μl 反应液，加入到100 μl 感受态细胞中，缓慢吸打混匀，冰上放置30 min。42℃ 热激45~60 sec，冰浴5 min。加500 μl SOC或 LB 培养基，37℃ 振荡培养40~60 min（200 rpm）。将菌液均匀涂布在含有对应抗生素的平板上，倒置于37℃ 过夜培养。

注1：不同感受态细胞后的克隆阳性率会有所差别，推荐使用转化效率 > 108 CFU/μg的感受态细胞；

注2：菌落数取决于PCR 产物与线性化载体的数量和纯度；

注3：阳性对照平板通常生长大量白色单菌落，阴性对照平板只生长很少的菌落。

7. 阳性克隆检测

挑取单菌落至10 μl ddH2O 中混匀，95℃裂解10 min 后，取1 μl裂解液作为模板，进行菌落PCR 鉴定，或将单菌落接种至抗性培养基中培养过夜后，提取质粒进行酶切鉴定。

阳性对照的阳性克隆检测，菌落PCR 引物使用通用引物M13F 与M13R，酶切鉴定用HindIII 与EcoRI。

注1：菌落PCR 时建议至少使用一条通用引物，避免假阳性结果；

注2：必要时可进一步对阳性结果进行测序鉴定。

注3：M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT

M13R：CAGGAAACAGCTATGAC