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技术文章

cck8检测细胞增殖与毒性完美替代MTT法_MedChemExpress

点击次数:974 发布时间:2018/3/22 15:09:45

产品概述
Cell Counting Kit-8,简称 CCK-8 试剂盒,是一种基于 WST-8 而广泛应用于
细胞增殖和细胞毒性的快速、高灵敏度、无放射性的比色检测试剂盒。
CCK-8 溶液可以直接加入到细胞样品中,不需要预配各种成分。WST-8 在
电子耦合试剂存在的情况下,可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色
的formazan  。细胞增殖越多越快,则颜色越深;细胞毒性越大,
则颜色越浅。对于同样的细胞,颜色的深浅 (生成的 formazan 量) 和细胞数
目呈线性关系

细胞增殖 -毒性检测 
1. 在96 孔板中配制 100 ml的细胞悬液。将培养板在培养箱预培养 24小时 ( 在37℃, 5% CO2的条件下 )。 
2. 向培养板加入10 ml不同浓度的待测物质。 
3. 将培养板在培养箱孵育一段适当的时间 (例如: 6,12, 24 或48小时 )。          
4. 向每孔加入10 ml CCK-8 溶液 (注意不要在孔中生成气泡,它们会影响 O.D值的读数) 。 
5. 将培养板在培养箱内孵育 1-4小时。 
6. 用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。 
7. 如果暂时不测定O.D值,打算以后测定的话,可以向每孔中加入 10 ml 0.1 M HCl溶液或者1% w/vSDS 溶液,并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在 24小时内吸光度不会发生变化。 注意:如果待测物质有氧化性或还原性的话,可在加 CCK-8之前更换新鲜培养基,去掉药物的影响。当然药物影响比较小的情况可以不更换培养基,直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。

注意事项
1. CCK-8 的培养时间一般为 1-4 小时,但在培养 30 分钟左右即可取出肉眼
观察显色程度,根据细胞种类而定,需要摸索条件,CCK-8 的*佳反应时
间以具体显色的*佳时间为准。
2. 使用 96 孔板进行检测时,如果细胞培养时间较长,一定要注意蒸发问
题。一方面,由于 96 孔板周围一圈*容易蒸发,可以采取弃用周围一圈
的办法,改加相同量的 PBS 、水或培养液;另一方面,可以把 96 孔板置
于靠近培养箱内水源的地方,以缓解蒸发。
3. 本试剂盒的检测依赖于脱氢酶催化的反应,所以还原剂 (例如一些抗氧
化剂) 会干扰检测,如果待检测体系中存在较多的还原剂,需设法去除。
用酶标仪检测前需确保每个孔内没有气泡,否则会干扰测定。
4. 加入药物中如含有金属,对 CCK-8 显色有影响。终浓度为 1 mM 的氯化
亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制 5% 、15% 、90% 的显色反应,使灵敏度降
低。如果终浓度是 10 mM 的话,将会 100% 抑制。
5. 培养基中的酚红不会影响实验结果,酚红的吸光度可以在计算时,通过
扣除空白孔中本底的吸光度而消去,因此不会对检测造成影响。
6. 本产品可以检测 ,但不能检测酵母细胞。向 100 μL 培养液
中加入 10 μL CCK-8 溶液,并培养 1-4 小时或过夜。
7. CCK-8 试剂对细胞的毒性非常低。它和活细胞内的脱氢酶持续反应使溶
液颜色不断加深,OD 值不断增加 (注: 活细胞内的脱氢酶是持续产生的) 。
8. 要测定细胞的具体数量,建议同时做标准曲线。
9. 建议采用多通道移液器,以减小平行孔间的差异。
10. 以下方法可以终止 CCK-8 反应 (96 孔板) :
(a). 在显色反应后,将培养板放置 4°C 冰箱内。(b). 每孔加 10 μL 0.1 M HCl
溶液。(c). 每孔加 10 μL 1% (w/v) 的 SDS (十二烷基硫酸钠) 溶液。
注意:反应停止后,应在 24 小时内测定。
11. 本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不
得用于食品或药品。
12. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

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