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技术文章
PCR 核酸检测试剂盒 | MedChemExpress
点击次数：458 发布时间：2021/9/23 9:53:18
首先我们需要知道：就现有检测手段来说，检测的是样品中病毒核酸片段，而非完整的病毒核酸，更不是活病毒。新冠患者好后，活病毒被免疫系统清除，但是体内可能仍然存在病毒核酸碎片，因此核酸检测结果仍可能呈阳性。此时的阳性结果，不代表患者体内一定存在完整的病毒核酸或者活病毒！
目前核酸检测主要的操作是，采取咽拭子或鼻拭子，取样后，做病毒核酸的实验室检测：提取标本中的 RNA，并逆转成 cDNA，用病毒 cDNA 的特异性引物进行 PCR 扩增。如扩增的产物，出现病毒特异性的 DNA，则病毒核酸检测结果为阳性。
新型冠状病毒 (SARS-CoV-2) 是一种 RNA 病毒，新冠病毒患者样本含病毒的遗传物质 RNA，核酸检测大概率呈阳性。(核酸结果阴性也不能排除病毒感染，要结合症状、血常规及肺部 CT 等检查，逐一分析，综合判断。）
基于 RT-PCR 进行的核酸检测[1]
◐ 实验设计：
分别以 SYBR Green qPCR Master Mix、Primer 和 ddH2O 点样跑电泳。
为什么单独用 Mix 跑核酸电泳会有一个小条带？
此款 qPCR Mix 所用的酶为配体法修饰的热启动 DNA 聚合酶，该配体为核酸。因此直接用酶跑电泳时，会存在一个小条带。
收！说了这么多，讲重点！针对核酸检测中的假阴性问题，有没有好的解决方案呢？
额~目前还没有新冠检测筛查标准。所以联合检测手段是目前比较好的方式，即同时应用 2 种或 2 种以上诊断方式来检测。目前的检测手段有鼻拭子和咽拭子、肺泡灌洗液检验、血液抗体检测、粪便和肛拭子，及胸片/CT 等影像学等手段，还可以结合环境样本和阴性对照做验证排除。
萌 Cece 分析解答：模板可能包含杂蛋白。建议配制稳定有效的消化处理液。同时，模板的溶解液固定不变 (比如：Tris-HCl 缓冲液)。
萌 Cece 分析解答：引物可能质量不太好，或者浓度设计不合适，及引物设计不合理，如长度不够，引物本身或两条引物之间形成二聚体等。建议更换引物。引物应高浓度小量分装保存，以防止反复冻融或一直冷冻保存，导致引物的变质降解失效。
萌 Cece 分析解答：Mg2+ 浓度对 PCR 扩增效果影响极大，浓度过高可降低 PCR 扩增的特异性，过低则影响 PCR 扩增产量甚至使 PCR 扩增失败，出现假阴性。建议设置一组反应，每一反应中的其他离子浓度相同 (如 Tris、KCl 等)，而 MgCl2 浓度不同，来摸索浓度。
萌 Cece 分析解答：变性温度低，时间短；退火温度过高，影响引物与模板的结合而降低扩增效率；延伸时间过短。建议提高变性温度，延长变性时间，尤其一次循环。退火温度应根据 Tm 值来设定。延伸时间必要时适当延长。
除此之外，就是*讨厌的“出现非特异性扩增带”
萌 Cece 分析解答：Mg2+ 浓度过高，退火温度过低，PCR 循环次数过多；酶的质量不过关；引物与靶序列不全互补，或引物聚合形成二聚体，都有可能出现非特异性扩增带。建议适当提高退火温度；更换新酶；降低引物量，适当增加模板量，减小循环次数。必要时重新设计合成引物。
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参考文献
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1. Nidhi Verma, et al. Emerging diagnostic tools for detection of COVID-19 ａnd perspective. Biomed Microdevices. 2020 Nov 24;22(4):83.
2. Wenling Wang, et al. Detection of SARS-CoV-2 in Different Types of Clinical Specimens. JAMA. 2020 May 12; 323(18): 1843-1844.
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