PROTAC 本质

      PROTAC 是一种杂合双功能小分子化合物，结构中含有两种不同配体，一个是泛素连接酶 E3 配体，另一个是与细胞中目标靶蛋白结合的配体，两个配体之间通过 Linker 相连，从而形成“三体”聚合物——靶蛋白配体-Linker-E3 配体。然后通过 E3 连接酶给靶蛋白加上泛素化标签，启动细胞内强大的泛素化水解过程，通过泛素-蛋白酶体途径特异性地降解靶蛋白。

PROTAC 原理

      PROTAC 分子在进入细胞后，其结构中的目标蛋白（Protein of interest, POI）配体可特异性地与相应的靶蛋白结合，而另一端可以募集 E3 连接酶从而形成 POI-Linker-E3 ligase 三元复合物，其中 E3 连接酶可介导泛素结合酶 E2 对 POI 泛素化。被泛素标记的 POI 被蛋白酶体识别并降解。此过程无需靶蛋白配体长时间占据结合位点，只需三元复合物短暂的形成便可瞬时完成目标蛋白的泛素化，并且 PROTAC 在细胞内可多次循环利用。

泛素-蛋白酶体途径

      细胞中的很多信号通路是通过泛素-蛋白酶体途径选择性降解某些关键调控蛋白来实现调控的。细胞内每时每刻都有数以千计的蛋白泛素化过程在进行,这种对特定蛋白高度特异的识别机制主要是由 E3 泛素连接酶决定的。

      泛素-蛋白酶体途径（ubiquitin-proteasome pathway, UPP）：是细胞内蛋白降解的主要途径，参与细胞内 80% 以上蛋白质的降解。泛素分子在一系列酶作用下，将细胞内的蛋白质分类，从中选出靶蛋白分子，对靶蛋白进行特异性修饰的过程，形成靶蛋白多聚泛素链。这些酶包括泛素激活酶（E1），泛素结合酶（E2）、泛素连结酶（E3）等。这一过程是一个三酶级联反应。靶蛋白被泛素（多肽）标记，然后被蛋白酶体识别和降解。通过这样一个需要消耗能量的过程，细胞以高度特异方式对不需要的蛋白进行降解。值得一提的是，泛素化过程也是可逆的，泛素可被去泛素化酶（Deubiquitinase, DUB）从泛素链上去除，形成反向调节。

      泛素化在蛋白质的代谢、调节和降解中起重要作用，蛋白质泛素化是生物体内一种常见的翻译后修饰，同时参与细胞周期、凋亡、分化等几乎一切生命活动的调控。泛素化与肿瘤、心血管、自身免疫等疾病的发病密切相关。

      泛素分子(Ubiquitin)：是一种由 76 个氨基酸组成的小蛋白。具有高度保守的序列且存在于所有已知的真核生物体中。主要功能是标记需要分解掉的蛋白质，使其被蛋白酶体降解。泛素链与蛋白底物的结合形成被蛋白酶体降解的识别信号。单独的泛素本身并没有任何生物功能，只是一种分子标记蛋白，发挥作用必须在 ATP 提供能量的前提下依靠泛素途径的相关酶类及蛋白酶体。

      蛋白酶体 (Proteasome)：26S 蛋白酶体是 ATP 依赖型蛋白水解复合体，由 2 个 19S 调节亚单位，1 个 20S 核心亚单位， 和 11S 调节因子构成；组成一种桶状结构，2 个 19S 亚单位位于桶状结构的两端，识别多聚泛素化蛋白并使其去折叠。20S 为催化亚单位，位于两个 19S 亚单位的中间，其活性部位处于桶状结构的内表面，可避免细胞环境的影响。20S 有胰蛋白酶、糜蛋白酶和谷氨酰样肽水解活性，可以裂解大多数的肽键。

PROTAC 相关产品

ARV-771 是一种通过 PROTAC 技术形成的有效 BET 降解剂。对 BRD2(1)，BRD2(2)，BRD3(1)，BRD3(2)，BRD4(1) 和 BRD4(2) 的 Kd 值分别为 34，4.7，8.3，7.6，9.6 和 7.6 nM。ARV-771 一端是泛素连接酶 E3 配体，另一端是与靶蛋白 BET 结合配体，两个配体之间通过 linker 相连，从而使 ARV-771 特异性低降解 BET 蛋白。

dBET1 由 BRD4 抑制剂 JQ1（HY-13030）与 Thalidomide 衍生物通过 Linker 产生的 PROTAC。能够在低纳摩尔浓度下诱导 BRD4 降解 dBET1 显着降低了 BRD2、BRD3 和 BRD4 水平，同时具有较小的脱靶降解效应。

BI-3663 由 PTK2/FAK 抑制剂 BI-4464 与 Pomalidomide 衍生物通过 Linker 产生的PROTAC。能够在低纳摩尔浓度下诱导 PTK2 降解。

多样化的 E3 连接酶

目前已经发现有 600 多种 E3 泛素连接酶复合体，下面介绍研究*热的 2 种：von Hippel-Lindau (VHL) 型和 Cereblon (CRBN) 型。

Cullin蛋白

Cullin (Cul) 家族可形成调节细胞周期的活性复合体。Cullin (Cul) 家族有 6 个成员蛋白Cul1， Cul2，Cul3, Cul4, Cul5, Cul7。

N 端有 Cul 重复结构 (Cul repeat, CR)

 

C 端有 Cul 同源区 (Cul homology, CH) , Neddy8 修饰位点：转录后修饰。

一种：Von Hippel-Lindau (VHL) 型 E3 泛素连接酶复合体

VHL 基因是一种抑癌基因,其蛋白产物 VHL 可与 ElonginB、ElonginC、Cullin2 蛋白组成 VBC (VHL-ElonginB/C-CUL2) 复合物,该复合物属于 E3-泛素蛋白酶系统，介导人体内多种蛋白的降解。癌症中 VHL 经常发生突变，近 70% 的突变都是破环了 VHL 与 Elongin 的结合。

第二种：Cereblon (CRBN) 型 E3 泛素连接酶复合体

羟脑苷脂 (Cereblon, CRBN) 是一种具有离子蛋白酶活性的大脑相关蛋白，可与 DNA 损伤结合蛋白-1 (DDB1)、滞蛋白 4 (Cullin4, Cul4A 或 Cul4B) 和调节因子 Cullins 1  (RoC1) 相互作用形成功能牲 E3 泛素连接酶复合体 (CRBN-CRL4)，结合底物后通过泛素-蛋白酶体途径进行蛋白水解。Cereblon也是免疫调节剂 (IMiD) 抗骨髓瘤作用的必需靶蛋白。Lenalidomide，和 Pomalidomide 等与 CRBN 结合时会招募新的底物，使其结合在 CRBN-CRL4 上，导致其泛素化和蛋白酶体依赖的降解增加。CRBN-CRL4 复合体对四肢的发育有重要作用。

Cullin 蛋白家族的其他成员也可形成不同的 E3 泛素连接酶复合体，如下图：

PROTAC Linker

PEG 类

PROTAC Linker 25 is a polyethylene glycol(PEG)-based PROTAC linker. 

Alkyl/ether 类

PROTAC Linker 2 is a Alkyl/ether based PROTAC linker.

Alkyl-Chain 类

PROTAC Linker 31 is a PROTAC linker, which refersto the Alkyl-Chain composition. 

SNIPER

      SNIPERs (specific ａnd non-genetic inhibitor of apoptosis protein (IAP)-dependentprotein erasers ) 是一系列凋亡蛋白抑制因子 (IAP) 特异性抑制剂，可募集 IAP 泛素连接酶来实现靶向降解。SNIPER - Hijacking IAP 活性以诱导蛋白质降解。与招募von Hippel-Lindau 和 cereblon 泛素连接酶的嵌合分子不同，SNIPERs 可以同时降解 IAP (例如 cIAP1 和 XIAP) 以及目标靶蛋白。

 

      Bestatin 是一种氨肽酶抑制剂。其甲酯化合物（MeBS）可通过 Bestatin 结构端与 cIAP1 的 BIR3 结构域结合，激活 cIAP1 的 E3 泛素化连接酶活性，诱导 cIAP1 发生字泛素化，然后被蛋白酶体降解。所以，在 MeBS 通过 linker 连接不同靶蛋白的小分子抑制剂，可以得到多个基于 cIAP1 E3 泛素化连接酶的 PTOTAC。但是，由于 MeBS 可以诱导 cIAP1 自身发生泛素化降解，因此很多基于此技术得到的 PTOTAC 在降解目标靶蛋白的同时会泛素化降低 cIAP1，导致很大程度上限制了其降低靶蛋白的效率。

      聪明的科学家们继续对 Bestatin 做进一步的结构改造，发现 Bestatin 的酰胺衍生物保留了与 cIAP1 的结合活性，且不会引起 cIAP1 的自身泛素化降解。如 SNIPER(ABL)-020，SNIPER(ABL)-044 等等。 

E3 Ligase Ligand-Linker Conjugate

E3 Ligase Ligand-Linker Conjugate Kit 是一个超级丰富的 E3 配体和 Linker 组合试剂盒。里面是一系列合成的化合物，结合了 E3 Ligase 配体和 Linker。另外还提供了不同的类型的 E3 Ligase 配体和多样化的 Linker 组合任君选择。 

PROTAC 优势

1.    用量小，毒性低

2.    克服靶蛋白突变

3.    避免过表达引起的耐药

4.    选择性高

5.    清除蛋白堆积

小 M 的小思考

鉴于大多数小分子抑制剂的可逆结合，通常需要较大的全身给药浓度和持续暴露以确保足够的抑制。在许多情况下，维持体内足够高的药物浓度具有挑战性的。所以，通过小分子诱导的蛋白降解来消除引起疾病的异常蛋白质正在发展为研究的新策略。PROTAC 技术可能令现在还无法成药的 80% 蛋白组被小分子药物调控。PROTAC 小分子研究进展目前主要集中在可靶向的靶点上。未来潜力是要靶向传统意义上不可靶向的靶点，比如转录因子、蛋白的骨架功能等。