3X FLAG peptide 是带有 FLAG 标签的多肽，包含三个重复的 Asp-Tyr-Lys-Xaa-Xaa-Asp 基序。3X FLAG peptide 可用于蛋白分离纯化，和目标蛋白竞争性洗脱。

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　　多肽3X FLAG peptide生物活性

　　体外研究

　　1. 通过 3X FLAG peptide 竞争纯化 FLAG 标签蛋白

　　(1) 质粒转染：将 FLAG 标记的 mIRS-1、hIRS-1 或其突变体的质粒转染到 293 T 细胞中，转染时间为 2 天。

　　(2) 收集细胞：在 4 °C 下以 14,000 rpm 离心 10 分钟收获细胞，并用 HEPES 缓冲液 (150 mM NaCl、50 mM HEPES、pH 7.4、5 mM EDTA、1% (w/v) 脱氧胆酸钠、1% (v/v) Triton X-100、0.2% 氟化钠、0.1% 原钒酸钠和蛋白酶抑制剂混合物) 裂解细胞。

　　(3) 利用 Anti-FLAG 磁珠进行蛋白分离与纯化：在细胞裂解液中加入Anti-Flag 磁珠 (HY-K0207)/Anti-c-Myc 磁珠 (1 μm) (HY-K0207A)，在室温下孵育 2 小时或在 4 °C 下孵育过夜。随后用洗涤缓冲液进行洗涤，并用含有 1 mg/mL 3X FLAG 的缓冲液进行洗脱。使用增加柱进行凝胶过滤以进一步纯化上清液，该柱使用储存缓冲液平衡。所有纯化的蛋白质均通过离心过滤浓缩，并分装储存在 -80 °C 下。

　　(4) 蛋白定量与验证：使用 ND-2000 Nanoｄrop 分光光度计以 OD 280 对纯化的蛋白进行定量，并通过考马斯亮蓝染色进行验证。

　　2. 通过 3X FLAG peptide 进行 Co-IP 和 co-IP–MS 分析

　　(1) 将细胞裂解液以 13300 rpm 在 4 °C 离心 15 分钟，去除完整细胞。

　　(2) 上清液用对照免疫球蛋白 G (IgG) 或一抗在免疫沉淀缓冲液 (150 mM NaCl、20 mM HEPES、pH 7.4、1% Triton X-100、12.5 mM β-甘油磷酸盐、1.5 mM MgCl2、2 mM EGTA，含有磷酸酶和蛋白酶抑制剂) 中过夜孵育，然后在 4 °C 下与 20 μL 重悬的 A/G 蛋白珠孵育 2 小时，以沉淀结合的蛋白质。

　　(3) 对于连续免疫沉淀，在 4 °C 下用 5 倍凝胶体积的 3X FLAG 洗脱溶液 (终浓度 150 ng/mL) 孵育 2 小时，从珠粒中洗脱结合的蛋白质，然后在 4 °C 下用二抗免疫沉淀过夜。珠子在 4 °C 下以 1000 g 离心 5 分钟，以去除上清液，用免疫沉淀缓冲液洗涤 4 次，并在 95 °C 下煮沸 20 分钟。

　　(4) 样品在 SDS-PAGE 凝胶上运行，然后染色 (Bio-Rad)。随后，切下胶带，脱色，胰蛋白酶消化，并进行 MS 分析，使用液相色谱-MS 确定个别蛋白质。