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AZD3965_MCT1 抑制剂
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AZD3965设计用于选择性抑制单羧酸转运蛋白-1(MCT1),因此预计会影响乳酸进出细胞的运动[1]。AZD3965处理导致缺氧COR-L103细胞内乳酸增加3.7倍,常氧和缺氧NCI-H1048细胞增加3.7倍和3.9倍。在所有其他情况下,观察到<1.9倍的增加。这些数据与AZD3965在细胞中阻断乳酸转运是一致的,其中AZD3965也减少细胞数量并且与通过抑制MCT1起作用的AZD3965一致。当MCT1过表达时,NCI-H1048的EC50在NCI-H1048细胞中从0.14nM增加至10.5nM。这与通过MCT1抑制起作用的AZD3965一致
体内
将携带COR-L103肿瘤的小鼠用100mg/kg AZD3965或载体BID处理21天,并监测肿瘤体积。药代动力学分析表明,100mg/kg AZD3965 BID导致预测的游离AZD3965浓度抑制乳酸转运。AZD3965治疗显着降低COR-L103肿瘤的生长,尽管未见肿瘤消退,与仅针对肿瘤缺氧部分的AZD3965一致
激酶测定
将细胞过夜接种并用100nM AZD3965或载体处理24小时。然后将细胞用PBS洗涤一次,用裂解缓冲液(50mM Mops,100mM KCl,5mM MgCl 2,1mM EDTA,0.1mM DTT,1mM PMSF补充1×mini完全蛋白酶抑制剂混合物片剂)洗涤两次。通过刮擦和离心收获细胞,将沉淀物在液氮中不用缓冲液快速冷冻。将冷冻的等份细胞在冰上解冻并重悬于裂解缓冲液中。细胞在液氮中冷冻3轮并在37℃解冻。每次2分钟,然后将裂解物离心(13000g,10分钟,4℃)直至澄清,然后储存在冰上。使用微量板读数器测定细胞裂解物中的酶活性,以测量细胞裂解物的产生或消耗。NADH/NADPH通过其在340/10 nm处的吸光度,由于直接或偶联的酶反应而发生。用于测定的96孔板在开始反应之前预热至37℃10分钟,由加入5μL细胞裂解液至95μL反应缓冲液(50mM Mops pH 7.4,100mM KCl,5mM游离镁)。补充标准反应缓冲液以测定不同酶的动力学。从相应反应的吸光度中减去对照的吸光度值。Graphpad棱镜6用于绘制V0值与底物浓度的关系,并确定Vmax和Km值。然后将Vmax标准化为细胞裂解物中的蛋白质浓度[1]。MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考
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AZD3965是一种选择性的MCT1抑制剂,抑制MCT1,Ki为1.6 nM。比作用于MCT2选择性高6倍,浓度高达10μM,也不抑制MCT3和4体外
AZD3965设计用于选择性抑制单羧酸转运蛋白-1(MCT1),因此预计会影响乳酸进出细胞的运动[1]。AZD3965处理导致缺氧COR-L103细胞内乳酸增加3.7倍,常氧和缺氧NCI-H1048细胞增加3.7倍和3.9倍。在所有其他情况下,观察到<1.9倍的增加。这些数据与AZD3965在细胞中阻断乳酸转运是一致的,其中AZD3965也减少细胞数量并且与通过抑制MCT1起作用的AZD3965一致。当MCT1过表达时,NCI-H1048的EC50在NCI-H1048细胞中从0.14nM增加至10.5nM。这与通过MCT1抑制起作用的AZD3965一致
体内
将携带COR-L103肿瘤的小鼠用100mg/kg AZD3965或载体BID处理21天,并监测肿瘤体积。药代动力学分析表明,100mg/kg AZD3965 BID导致预测的游离AZD3965浓度抑制乳酸转运。AZD3965治疗显着降低COR-L103肿瘤的生长,尽管未见肿瘤消退,与仅针对肿瘤缺氧部分的AZD3965一致
激酶测定
将细胞过夜接种并用100nM AZD3965或载体处理24小时。然后将细胞用PBS洗涤一次,用裂解缓冲液(50mM Mops,100mM KCl,5mM MgCl 2,1mM EDTA,0.1mM DTT,1mM PMSF补充1×mini完全蛋白酶抑制剂混合物片剂)洗涤两次。通过刮擦和离心收获细胞,将沉淀物在液氮中不用缓冲液快速冷冻。将冷冻的等份细胞在冰上解冻并重悬于裂解缓冲液中。细胞在液氮中冷冻3轮并在37℃解冻。每次2分钟,然后将裂解物离心(13000g,10分钟,4℃)直至澄清,然后储存在冰上。使用微量板读数器测定细胞裂解物中的酶活性,以测量细胞裂解物的产生或消耗。NADH/NADPH通过其在340/10 nm处的吸光度,由于直接或偶联的酶反应而发生。用于测定的96孔板在开始反应之前预热至37℃10分钟,由加入5μL细胞裂解液至95μL反应缓冲液(50mM Mops pH 7.4,100mM KCl,5mM游离镁)。补充标准反应缓冲液以测定不同酶的动力学。从相应反应的吸光度中减去对照的吸光度值。Graphpad棱镜6用于绘制V0值与底物浓度的关系,并确定Vmax和Km值。然后将Vmax标准化为细胞裂解物中的蛋白质浓度[1]。MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考
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