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Tozasertib是一种Aurora-A，Aurora-B，Aurora-C抑制剂，Ki值为0.6，18，4.6 nM

Tozasertib的生物活性

体外

Tozasertib诱导相似的细胞毒性，IC50约为300nM，并且在用ABL或FLT-3（突变型和野生型）激酶转染的BaF3细胞中表现出G2/M阻滞，核内复制和凋亡的AUR B样抑制表型。Tozasertib以时间依赖性方式阻止CAL-62增殖。Tozasertib处理14天显着降低了菌落的数量和大小，在8305C中降低了约70％，在CAL-62,8505C和BHT-101中降低了90％。用Tozasertib处理不同的ATC细胞抑制增殖，IC50在25和150nM之间。Tozasertib显着损害不同细胞系在软琼脂中形成菌落的能力。对胱天蛋白酶-3活性的分析表明Tozasertib诱导不同细胞系中的细胞凋亡。暴露于Tozasertib 12小时的CAL-62细胞显示DNA含量≥4N的细胞积累。延时分析表明Tozasertib处理的CAL-62细胞在不分裂的情况下退出中期。此外，Tozasertib治疗后组蛋白H3磷酸化被废除[2]。Tozasertib对患者来源样品中携带T315I突变的BCR-Abl具有显着的抑制活性

Tozasertib的实验参考方法

激酶测定

ATP的消耗通过丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶对与NADH的氧化偶联，可以通过340nm处的吸收减少来监测。反应包含100 mM Tris（pH 8），10 mM MgCl 2,2.2 mM ATP，1 mM磷酸烯醇丙酮酸，0.6 mg/mL NADH，75单位/mL丙酮酸激酶，105单位/mL乳酸脱氢酶和0.5 mM底物肽（序列：EAIYAAPFAKKK）。通过添加足够的激酶使反应达到30nM激酶浓度来开始反应（75μL），并且在微量滴定板分光光度计中在30℃下在30分钟内监测吸光度的降低。通过在100％DMSO或单独的DMSO中添加3.75μLTozasertib获得抑制常数。Ki值如下计算，Ki=IC 50/（1+[S]/Kd），其中[S]=[ATP]=2.2mM，Kd（ATP至Abl）=70μM。假设野生型和H396P Abl激酶结构域的Kd（ATP）为70μM，计算这些值。MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。

细胞分析

将托扎司他溶解在DMSO中。

在不存在（二甲基亚砜，DMSO）或存在500nM Tozasertib的情况下培养CAL-62细胞不同的时间段（1-5天）。通过用不同浓度的Aurora抑制剂（5-500nM）处理不同的ATC细胞4天来评估Tozasertib对细胞增殖的剂量依赖性作用。在孵育时间结束之前，将细胞用30mM BrdU脉冲标记2小时。使用细胞增殖elisa试剂盒通过比色免疫测定法分析BrdU掺入。将Tozasertib处理的细胞的结果与在对照细胞中观察到的结果进行比较，并表示为相对于对照的变异倍数。MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。

Animal Administration

Tozasertib在50％PEG 300的50mM磷酸盐缓冲液载体中制备。

对于HL-60研究，将雌性无胸腺NCr-nu小鼠皮下接种107个HL-60（TB）白血病细胞到右腋窝区域。腹膜内给药治疗。出价。肿瘤达到150-200 mm3后。Tozasertib在50％PEG 300的50mM磷酸盐缓冲液载体中制备。用盐水配制的顺铂腹膜内给药。q.4.d.总共三次注射，剂量为5.4 mg/kg。对于MIA PaCa-2研究，将雌性MF1裸鼠用107个MIA PaCa-2细胞接种到背侧。腹膜内给药治疗。出价。肿瘤达到175 mm3后。Tozasertib在50％PEG 300的50mM磷酸盐缓冲液载体中制备。用盐水配制的5-氟尿嘧啶静脉内给药。q.4.d.剂量为50毫克/千克。对于HCT116研究，将雌性Hsd RH rnu/nu大鼠用107个HCT116细胞接种到右胁腹。一旦肿瘤达到700-950mm 3，就进行治疗。Tozasertib通过留置的股动脉导管连续给药，然后在重复给药周期之前用盐水输注4天。对于所有研究，肿瘤体积通过卡尺测量每周三次测定。MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。 联系方式：