实验开始前，各试剂均应平衡至室温；试剂或样品配制时，均需充分混匀，并尽量避免起泡。                

1、 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。给酶标板覆膜，37℃孵育2小时。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。                

 2、 弃去液体，甩干，每个孔中加入Detection Ab工作液 100μl（在使用前15分钟内配制），酶标板加上覆膜，37℃温育1小时。                

 3、 弃去孔内液体，甩干，洗板 3次，每次浸泡1-2分钟，大约350μl /每孔，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。               

4、 每孔加HRP Conjugate工作液（临用前15分钟内配制）100μl，加上覆膜，37℃温育1小时。                

 5、 弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤3。                

 6、 每孔加底物溶液100μl，酶标板加上覆膜37℃避光孵育15分钟左右（根据实际显色情况酌情缩短或延长，但不可超过30分钟。当标准孔出现明显梯度时，即可终止）。                

 7、 每孔加终止液50μl，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。                

 8、 立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度（OD值）。应提前打开酶标仪电源，预热仪器，设置好检测程序。                

9、 实验完毕后将未用完的试剂按规定的保存温度放回冰箱保存至有效期结束。                

大鼠热休克蛋白40(HSP-40)ELISA试剂盒*今品化学新闻实验操作注意事项：                

1、 保存：试剂盒中各试剂请按说明书提示合理存放。在储存及温育过程中避免将试剂暴露在强光中。所有试剂瓶盖须盖紧或旋紧以防止蒸发和微生物的污染，否则可能会出现错误的结果。                

 2、 酶标板：刚开启的酶标板孔中可能会有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。               

3、 加样：加样或加试剂时，个孔与*后一个孔的加样时间间隔如果太大，将会导致不同的 “预温育”时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。每次的加样时间控制在10分钟内。推荐设置复孔实验。

4、 温育：为防止样品蒸发，实验时必须给酶标板覆膜；洗板后应尽快进行下步操作，避免酶标板处于干燥状态；严格遵守给定的温育时间和温度。                

5、 洗涤：洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在吸水纸上拍干，勿将滤纸直接放入反应孔中吸水。在读数前要注意清除孔底残留的液体和手指印，以免影响酶标仪读数。                

6、 试剂配制：Detection Ab及HRP Conjugate体积较小，运输过程会使液体沾到管壁或瓶盖，因此使用前请手甩几下或1000转/分离心1min，以使附着管壁或瓶盖的液体沉积到管底。取用前，请用移液器小心吹打4-5次使溶液混匀。标准品、Detection Ab工作液、HRP Conjugate工作液请依据所需的量配制使用，并使用相应的稀释液配制，不能混淆。请精确配制标准品及工作液，尽量不要微量配制（如吸取Detection Ab时，一次不要小于10μl），以避免由于不准确稀释而造成浓度误差；请勿重复使用已稀释过的标准品、Detection Ab工作液、HRP Conjugate工作液。若需要分次使用标准品应按照每一次用量分装，将其放在-20～-80℃贮存。避免反复冻融。                

7、 反应时间的控制：加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化（比如每隔5分钟），如梯度已很明显，请提前加入终止液终止反应，避免颜色过深影响酶标仪读数。               

8、 底物：底物请避光保存，在储存和温育时避免强光直接照射。                

9、  混匀：充分轻微混匀对反应结果尤为重要，使用微量振荡器(使用频率)，如无微     量振荡器，可在反应前手工轻轻敲击酶标板框混匀。                

10、 安全：试验中请穿着试验服并带乳胶手套做好防护工作。特别是检测血液或者其他体液标      本时，请按国家生物试验室安全防护条例执行。                

11、 不同批号的试剂盒组份不能混用（洗涤液和反应终止液除外）               

12、 试验中所用的EP管和吸头均为一次性使用，严禁混用，否则将影响试验结果！                

大鼠热休克蛋白40(HSP-40)ELISA试剂盒*今品化学新闻结果判断:                

1. 每个标准品和标本的OD值减去空白孔的OD值后作图，如设置复孔，则应取其平均值计算。以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘出标准曲线。                

2. 推荐使用专业的曲线制作软件，如curve expert 1.3，在软件界面既可根据样品OD值，由标准曲线查出相应的浓度，乘以稀释倍数；亦可用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的回归方程式，然后将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。                

3. 若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。