小鼠细胞凋亡因子配体(Fas-Ligand)elisa试剂盒*今品化学新闻中内容(96孔)

1． 重组人VEGF冻干标准品，10ng/管，总2管。

2． 预包被抗人VEGF抗体的96孔板。

3． 样品稀释液，30ml。  

4． 生物素标记抗人VEGF，120μl，效价1：100。

5． 抗体稀释液，12ml。  

6． 亲和素-过氧化物酶复合物（ABC），120μl，效价1：100。

7． ABC稀释液，12ml。

8． TMB显色液，10ml。

9． TMB终止液，10ml。

需要而未提供的试剂和器材

1． 标准规格酶标仪。

2． 自动洗板机。  

3． 系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，用多通道移液器。

4． 干净的试管和Eppendof管。  

5． 使用中性PBS或TBS作为洗涤液。0.01M TBS配法为：1000ml H2O中加Tris 1.2g, NaCl 8.5g;  纯乙酸450μl或浓盐酸700μl左右调节pH值(7.2-7.6)。 0.01 M PBS（pH7.2-7.6）配法：1000ml蒸馏水中加氯化钠8.5g, Na2HPO4·12H2O 3.5g, NaH2PO4·2H2O  0.25g。

洗板方法  

手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的PBS或TBS洗涤缓冲液至少0.4ml注入孔内，浸泡1-2分钟。根据需要，重复此过程数次。  

自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。

小鼠细胞凋亡因子配体(Fas-Ligand)ELISA试剂盒*今品化学新闻操作程序  

所有试剂用前需在室温平衡。试剂或样品稀释时，切不可忘记混匀。每次检测都应该做标准曲线。如果估计样品VEGF浓度＞2000pg/ml时，应在试管中将样品用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。  

1． 确定本次检测所需的已包被抗体的酶标板孔数目，并增加1孔作为TMB空白显色孔。总数=样品数+9；做双份检测时×2。其余重包装好放如冰箱中。  

2． 将1000pg/ml ，500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.3pg/ml，15.6pg/ml的标准品各0.1ml依次加入一排7孔中，1孔只加样品稀释液的作为零孔。对于人血清、体液、组织匀浆或细胞培养上清，每孔先加50μι样品稀释液，再加50μι样品。

3． 酶标板加上盖，37℃反应120分钟。

4． 反应后用自动洗板机吸去酶标板内的液体（将自动洗板机的洗涤次数设为零再开始即可）；或甩去酶标板内液体，再对着吸水纸拍几下。不洗。

5． 将准备好的生物素抗人VEGF抗体工作液按每孔0.1ml依次加入（TMB空白显色孔除外）。37℃反应60分钟。  

6． 0.01M TBS或0.01M PBS洗涤3次，每次浸泡1分钟左右。吸去或甩去多余液体。

7． 将准备好的ABC工作液按每孔0.1ml依次加入（TMB空白显色孔除外）。37℃反应30分钟。

8． 0.01M TBS或0.01M PBS洗涤5次，每次浸泡1-2分钟左右。吸去或甩去多余液体。

9． 按每孔0.1ml依次加入TMB显色液，37℃避光反应20-25分钟（此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔差别不明显）。  

10． 按每孔0.1ml依次加入TMB终止液，此时蓝色立转黄色。  

11． 用酶标仪在450nm测定O.D.值，将TMB空白显色孔设为对照。  

12． 所有的标准品和样品的吸光值减去零孔的吸光值后，在坐标纸上画出曲线，以吸光值作为纵坐标，以浓度作为横坐标。  

13． 根据样品的吸光值在坐标上找出对应的浓度。用户也可以使用各种应用软件来计算(下载)。应记住由于样品稀释了1倍，其实际浓度应该×2。

小鼠细胞凋亡因子配体(Fas-Ligand)ELISA试剂盒*今品化学新闻操作程序总结：  

1． 加样品和标准品，37℃反应120分钟。不洗。  

2． 加生物素标记抗体，37℃反应60分钟。0.01M TBS洗涤3次。

3． 加ABC，37℃反应30分钟。0.01M TBS洗涤5次。

4． TMB37℃反应20-25分钟。

5． 加入TMB终止液，读数。