定量检测试剂盒（ELISA）说明书

【产品名称】

通用名称：大鼠血管内皮生长因子(VEGF)定量检测试剂盒（ELISA）

英文名称：Rat Vascular Endothelial cell Growth Factor（VEGF)）ELISA KIT

【包装规格】

96人份/盒

【预期用途】

仅供科研使用，定量检测血清、血浆、细胞培养上清液中大鼠血管内皮生长因子 (VEGF)的浓度。

【检验原理】

本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附检测技术。特异性抗大鼠 VEGF 抗体预包被在高亲和力的酶标板上。酶标板孔中加入标准品、待测样本和生物素化的检测抗体，经过孵育，样本中存在的 VEGF 与固相抗体和检测抗体结合。洗涤去除未结合的物质后，加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(Streptavidin-HRP)。洗涤后，加入显色底物 TMB，避光显色。颜色反应的深浅与样本中 VEGF 的浓度成正比。加入终止液终止反应，在 450 nm 波长(参考波长 570 - 630 nm)测定吸光度值。  

【主要组成成分】

主要成分

注意：使用请检查试剂盒中试剂的标签和数量与表格是否一致

需要但未提供的材料及耗材

  1、酶标仪

2、精密移液器及一次性吸头

3、蒸馏水

4、洗瓶或者自动洗板机

5、37℃水浴锅或恒温箱

6、500ml量筒

7、无粉一次性乳胶手套

【储存条件及有效期】

  1、2-8℃保存，切勿冷冻，有效期6个月。

  2、开封使用后，包被微孔板放入带有干燥剂的自封袋中，密闭自封袋，并将全部试剂放回2-8℃冰箱。

【适用仪器】

  半自动的酶标仪，如Thermo MK3，或者国产酶标仪。

【样本要求】

  样本类型和采集

细胞培养上清

 300 g 离心 10 分钟去除沉淀物，即刻检测, 或者分装，-20℃以下贮存。

血清样本

分离管分离血清。在 1000 g 离心之，使血样凝集 30 分钟。吸取血清样本之后即刻检测，或 者分装，-20℃以下贮存。

血浆样本

EDTA、枸橼酸钠或肝素抗凝收集血浆样本。1000 g 离心 3 0 分钟收集样本。即刻检测，或者 分装，-20℃以下贮存。 本试剂盒可能适用于其它生物学样本。

细胞培养上清、血清和血浆已经过验证。

注意：检测，样本中可见的沉淀必须去除。不要使用严重溶血或高血脂的样本。 样本应分装并贮存于-20℃，以避免大鼠VEGF活性的丢失。如果在 24 小时内检测，样本可以 存放在 2 - 8℃。 避免样本的反复冻融。在检测，冷冻样本应该缓慢地恢复至室温，轻柔地混匀。

样本保存和稳定性

样本在2-8℃条件下，可以储存72h，或者在- 20℃储存6个月。样本收集后，不是一次检测完，请按一次用量分装冻存，避免反复冻融，使用时在室温下解冻，确保样品均匀充分解冻。

【检验方法】

试剂准备

检测请将所有的试剂、样本恢复至室温。 如果浓缩的试剂出现结晶，37℃温浴，直至结晶全部溶解。

1×洗液

吸取 20×浓缩洗液 30 ml 至 1 L 的量筒，加蒸馏水或去离子水至600 ml，轻轻混匀，避免泡 沫。 转移至干净瓶内。2 - 25℃贮存，1×洗液可稳定 30 天。

1×检测缓冲液

 吸取 10×浓缩检测缓冲液 5 ml 至 100 ml 量筒，加蒸馏水或去离子水至 50 ml，轻轻混匀，避 免泡沫。 2 - 8℃贮存，1×检测缓冲液可稳定保存 30 天。

检测抗体

稀释充分混匀。根据标准品和待测样本的数量，用 1×检测缓冲液按 1：100 稀释浓缩的检 测抗体。 注意：请在 30 分钟内使用稀释后的检测抗体。

 辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素

稀释充分混匀。 根据标准品和待测样本的数量，用 1×检测缓冲液按 1：100 稀释浓缩的辣根过氧化物酶标记的 链霉亲和素。 注意：请在 30 分钟内使用稀释后的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。

样本稀释

如果样本需要稀释，请用试剂盒提供的 1×检测缓冲液稀释血清/血浆样本，用细胞培养基稀释 细胞培养上清。

大鼠VEGF标准品

用蒸馏水或去离子水重溶大鼠 VEGF标准品，重溶体积标注在大鼠VEGF标准品的标签上（300pg冻干品中加入500ul标准品稀释液）。轻柔 地涡旋震荡，确保充分混匀，重溶后标准品的浓度为5000 pg/ml。重溶后静置 10 - 30 分钟。稀释 充分混匀。 请使用聚丙烯管进行标准品稀释。

标准曲线制作

血清/血浆样本标准曲线的制作：

取 230 μl 浓缩的大鼠 VEGF标准品，加入 230 μl 标准品稀释液，作为标准曲线的浓度 (2500pg/ml)。在每一个试管中加入 230 μl 标准品稀释液。使用高浓度标准品做 1：1 系列稀释。每次移 液时，请确保充分混匀。以标准品稀释液作为标准曲线的零浓度。

（标准品浓度依次为：2500,1250,625,312.5,156.25,78.125,0pg/mL）

 细胞培养上清样本标准曲线的制作： 

取 230 μl 浓缩的大鼠 VEGF标准品，加入 230 μl 细胞培养基，作为标准曲线的浓度 (2500 pg/ml)。在每一个试管中加入 230 μl 细胞培养基。使用高浓度标准品做 1：1 系列稀释。每次移液 时，确保充分混匀。以细胞培养基作为标准曲线的零浓度。

（标准品浓度依次为：2500,1250,625,312.5,156.25,78.125,0pg/mL）

【检测步骤】 

检测之请将所有的试剂、样本平衡至室温。

1. 准备好所有需要的试剂及工作浓度标准品。

 2. 将不需要的板条拆卸下来，放回装有干燥剂的铝箔袋，重新封好封口。

3. 浸泡酶标板：加入 300 μl 1×洗液静置浸泡 30 。为了获得理想的实验结果浸泡是必须的。弃掉洗液之后， 在吸水纸上将微孔板拍干。洗板完成之后，请立即使用微孔板，不要让微孔板干燥。

4. 加标注品：标准品孔加入 100 μl 2 倍倍比稀释的标准品。空白孔加入 100 μl 标准品稀释液（血清/血浆样）或培养基（细胞培养上清样本）。

5. 加样本：血清/血浆：样本孔加入 80 μl 1×检测缓冲液和 20 μl 样本。细胞培养上清：样本孔加入100ul细胞培养上清。 

6. 加检测抗体：每孔加入 50 μl 稀释的检测抗体。步骤 4、5、6 连续加样，不要间断。加样过程在 15 分 钟内完成。

7. 孵育：使用封板膜封板。300 转/分钟振荡，室温孵育 2 小时。

8. 洗涤：弃掉液体，每孔加入 300 μl 洗液洗板，洗涤 6 次。每次洗板，在吸水纸上拍干。为获得理想的 实验性能，必须移除残留液体。

9. 加酶孵育：每孔加入 100 μl 稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。

10. 孵育：使用新的封板膜封板。300 转/分钟振荡，室温孵育 30分钟。

11. 洗涤：重复步骤 8。

12. 加底物显色：每孔加入 100 μl 显色底物 TMB，避光，室温孵育 5 - 30 分钟。

13. 加终止液：每孔加入 100 μl 终止液。颜色由蓝色变为黄色。如果颜色呈现绿色或者颜色的变化明显不均 匀，请轻轻叩击板框，充分混匀。

14. 检测读数：在 30 分钟之内，使用酶标仪进行双波长检测，测定 450 nm 吸收波长和 570 nm 或 630 nm 参考波长下的 OD 值。校准后的 OD 值为 450 nm 的测定值减去 570 nm 或 630 nm 的测定值。 仅使用 450 nm 测定会导致 OD 值偏高，并且准确度降低。

【结果计算】

计算标准品和样本的平均 OD 值，然后减去零浓度标准品的 OD 值。 以标准品浓度为横坐标，OD 值为纵坐标，用计算机软件进行回归拟合生成标准曲线。回归分 析确定拟合曲线。通过对浓度值和 OD 值取对数拟合，可以对标准曲线进行线性化。此过程 可能可以得到更多样本的浓度，但数据的准确度会降低一些。

注意：标准曲线浓度点的终浓度为2500 pg/ml。如果按照说明书的步骤操作 (20 μl 样本 + 80 μl 检测缓冲液)，计算样本浓度时请乘以稀释因子5。如果样本进行了其它方式的稀释，计 算样本浓度时请乘以相应的稀释倍数。

【检验方法的局限性】

1、仅供科研使用，不得用于临床诊断。

2、在试剂盒标示的有效期内使用，过期产品不得使用。

3、跟其他厂家的试剂盒或者组分不能混用。

4、使用试剂盒配套的样品稀释液。

5、如果样本值高于标准品浓度值，请将样本适当稀释后，再重新测定。

6、待测样本中存在的人抗鼠等异嗜抗体会干扰检测结果，检测，请排除该因素。

7、通过其他方法得到的检测结果，与本试剂盒测定结果不具有直接的可比性。

【产品性能指标】

1、物理性能

试剂盒的各液体组分应澄清透明、无沉淀或者絮状物。微孔板铝箔袋应真空包装，无破损漏气。

2、剂量反应曲线线性

校准品剂量反应曲线相关系数r值，大于等于0.9900。

3、精密度

批内精密度：三组已知的高、中、低浓度样品，进行二十次在同一个板块内精度评估。批内变异系数CV%小于10%。

批间精密度：三组已知的高、中、低浓度样品，进行二十次在不同板块内精度评估。批间变异系数CV%小于15%。

4、检测范围

39.06pg/ml→2500pg/ml

5、灵敏度

检出剂量小于2.41pg/mL。

6、回收率

三组已知的高、中、低浓度样品，进行五次回收率评估，回收率在85%-115%之间。

7、特异性

本试剂盒识别天然和重组大鼠VEGF，与结构类似物无交叉。

8、稳定性

    2℃-8℃保存，有效期6个月。

【注意事项】

生物安全

1、检测必须符合实验室管理规范的规定，严格防止交叉污染，所有样品、洗弃液和各种废弃物都应按照传染物进行处置。

2、试剂盒的液体组分中，含有proclin-300防腐剂，可能引起皮肤过敏反应，避免吸入烟雾与皮肤接触。

3、底物液对皮肤、眼睛和上呼吸道有刺激作用，避免吸入烟雾。戴上防护手套，实验完成后技术提示

1、混合蛋白溶液时，避免起泡。

2、加校准品与样本时，每个校准品浓度和样本都要更换移液枪头，公共组分应该悬臂加样，避免交叉污染。

3、合适的温育时间，和充分的洗涤步骤，是实验结果准确性的必要条件。

4、底物溶液为无色液体，保存过程中变为蓝色，代表底物溶液已经失效，不得使用。

5、终止液加样顺序与底物溶液加样顺序一致，加入终止液后，蓝色底物产物，会瞬间变为黄色。

6、实验中，用剩的板条，应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。

7、所有液体组分，使用充分摇匀，严格按照说明书标明的时间、加样量及加样顺序进行温育操作。

废物处理

  所有使用或未使用的试剂，所有污染性的一次性材料，应当遵循传染性或潜在传染性产品的处理程序，每个实验室都有责任根据其实验的类型和危险性别，进行废物和污物的处理，同时要严格依照有关规定对待所有的废物和污物。

原创作者：晋江市华峰机械有限公司