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蛋白质定量实验:胺衍生法
点击次数：225 发布时间：2018/8/23 14:02:08
蛋白质的量是蛋白质纯化过程中需要检测的一项重要指标，在计算得率或物料平衡或测定目标蛋白质的比活/效价 (potency) 时都要涉及。有各种平台和方法可用于蛋白质定量。这些将会在本书的其他章节进行描述。这一章我们将集中讨论水溶液中蛋白质的分光光度检测，它不需要酶/化学性消化，也不需要在分析前对混合物进行分离操作。
实验步骤
实验步骤
1.于分析前至少 30 min 将 15uL 2-巯基乙醇加人到 5 mL OPA 储存液中, 这一试剂可稳定维持一天。所有荧光样品和相关反应在所有时间内都需要避光。
2.蛋白质标准品 (0.2~10 ug/mL) 和未知浓度的待测样品在分析前需要调节 pH 至 8.0?10.5。将 10 检测样品与 1 〇〇^xLOPA 储存液 (含 2-巯基乙醇) 混合，于室温下孵育 15 min。
3.加入 3 mL 0.5mol/L 的 NaOH, 混勻。
4.在激发光为 340nm, 发射光为 440~455nm 处，于荧光比色皿内对荧光进行读数。
5.在检测的动态范围内蛋白质浓度和荧光之间的联系应该是线性的，可以用来估计未知样品的浓度。
注释
相比基于吸光度的蛋白质定量分析方法，这 3 种染料都提供了更好的灵敏度和动态范围。由于染料在水溶液中的水溶性和稳定性更佳，所以 OPA 检测法普遍优于荧光胺检测法。
使用胺衍生试剂对蛋白质进行定量具有一定的局限性，因为该检测方法显示出很大的蛋白质与蛋白质间的变异性，其原因是蛋白质中赖氨酸残基的数量不同，同时它需要一个「匹配」的标准品。该检测方法易被缓冲液中含有的甘氨酸、胺、铵离子和许多生物缓冲液中常见的硫醇所干扰，因而限制了它的应用（表 8.1)。检测的重复性取决于反应的 pH、蛋白质样品是否含有残余的酸性物质等。例如，来自于沉淀操作的样品，可减少胺的衍生率 (Youetal.，1997)。
一种非共价的胺活性染料—Epicocco，也可用于溶液中总蛋白质量的检测 (Sigma)，这一方法的机制已有报道 (BellandKaruso，2003;Coghlanetal.，2005)。
原创作者：上海远慕生物科技有限公司
