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G418溶液(geneticin,20mgml)说明书
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文件大小：35kb
上传时间：2019/3/20 16:50:05
文件类型：doc
上 传 者：上海远慕生物科技有限公司
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操作步骤（仅供参考）：
1、 由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同批次的G418的活性液不同，所以在筛选之前，需要确定G418的*佳筛选浓度，一般在50～1000μg/ml范围内进行筛选。
2、 将细胞制备成细胞悬液，并稀释到1000个/ml。
3、 加入不同量的G418 solution (20mg/ml)，选择在10~14天内使细胞全部死亡的G418浓度来进行下一步的筛选试验。
注意事项:
1、 尽量减少反复冻融的次数，以免失效。
2、 基因转染到细胞内要一段时间才能表达出蛋白质, 所以筛选不能太早。
3、 筛选也不宜太迟，一般要在转染24h之后才开始加G418筛选。因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，*终导致筛选不出阳性克隆。
4、 随着细胞代谢，G418的浓度和活性都会下降，应每3~5天更换一次含有G418的筛选液，这时药物浓度可以降至200μg/ml。
5、 加药筛选约5～7天左右，细胞会大量死亡，为了减少死亡细胞对阳性克隆的不利影响以及增加阳性克隆的得到率，可以应用套环法或刮除法结合有限稀释法来筛选阳性克隆。加药后，在高倍镜下，刮除阴性克隆，消化阳性克隆后继续筛选培养。或者用套环套住阳性克隆，在套环内加胰蛋白酶或EDTA消化，把消化液吸到另外一个新的孔中培养，*后再用有限稀释法把阳性克隆在96孔板中筛选。
6、 一般经过4周左右的筛选，得到的阳性克隆都比较稳定。但是外源基因如果没有整合到基因组中的话，目的基因还是很容易丢失的，再次筛选往往是必不可少的，经过2次以的筛选之后才能找到遗传稳定的细胞克隆。
7、 尽量避免污染。
8、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
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