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细胞培养的生长测定-中国微生物菌种查询网
点击次数：412 发布时间：2018/9/25 11:21:17
细胞培养的生长测定是指对细胞活力和细胞增殖的测定。
一、细胞计数法
细胞计数法是用血细胞计数板计数细胞悬液中的细胞数目，以测定细胞增殖和调整细胞密度。
【材料】
1．消化液0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA混合消化液。
2．培养液。
3．血细胞计数板和盖玻片。
［操作程序】
1．处理贴壁生长细胞时，吸出培养液，加入消化液，在37℃条件下消化1一2分钟。待细胞变圆并将近脱壁时，加入一定量的培养液，用吸管冲洗细胞，制成细胞悬液。对于悬浮培养细胞，可直接制成细胞悬液。
2．将盖玻片放在血细胞计数板的2个小室上。用毛细吸管或装有注射针的1 m1注射器吸取少量细胞悬液，然后将细胞悬液轻轻注入盖玻片边缘与计数板交界处。通过盖玻片和计数板之间的毛细管虹吸作用，细胞悬液进入小室，并充满盖玻片和计数板的间隙。
3．在显微镜100倍放大倍数下用计数器计数10个大方格中的细胞，即每个小室的中央方格和四角的方格。将压左边中线和上边中线的细胞计数在内，不计数压右边中线和下边中线的细胞。如果是单室血细胞计数板，重复计数1次。
4．分别用双蒸水和70％乙醇清洗计数板和盖玻片，然后用擦镜纸擦干。
【结果分析】
1．细胞密度（个／ml)＝平均细胞数×104×稀释倍数。每个方格的容积为10-4ml。
2．细胞总数（个）＝细胞密度×细胞悬液量。
【注意事项】
1．如果被计数的细胞不再使用，在消化后不需要加入培养液。
2．在显微镜下观察细胞消化程度，以估计取细胞时间。消化时间过短时，部分细胞仍牢固贴壁，故取得的细胞较少，从而影响细胞计数。消化时间过长时，细胞受损伤，活性减弱。
3．将细胞悬液充分混匀，以免计数结果出现误差。
4．向盖玻片和计数板之间注入细胞悬液时，以盖玻片下的间隙刚被充满为准。不满或过满都可影响计数结果。
5．每个大方格中的细胞密度以20一50个为宜。如果细胞密度太大，稀释后再次计数，以便提高细胞计数的精确度和速度。
二、台盼蓝染色法
在原代细胞的分离、传代、冻存和复苏等过程，均可导致细胞死亡。台盼蓝染色法用于检测存活细胞数。
【材料】
1．消化液0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA混合消化液。
2．培养液或HBSS。
3. 0.4％台盼蓝溶液，用PBS配制。
4．血细胞计数板和盖玻片。
【操作程序】
1．如果是贴壁生长细胞，吸出培养液，加入消化液，在37℃条件下消化1一2分钟。然后，加入一定量的培养液或HBSS，制成细胞悬液。对于悬浮培养细胞，可直接制成细胞悬液。
2．取0. 5m1台盼蓝溶液、0. 3m1 HBSS和0. 2m1细胞悬液，充分混匀。然后，将混合液放置1一2分钟。
3．用毛细吸管或1 ml注射器吸取少量混合液，注入血细胞计数板小室。
4．至少计数500个细胞，并计数其中的着色细胞。
5．用双蒸水和70％乙醇清洗计数板和盖玻片，然后用擦镜纸擦干。
【结果分析】
1．正常细胞不被染色。细胞死亡后，细胞膜通透性增大，台盼蓝进入细胞内，故细胞呈蓝色。
2．细胞活力（％）＝（总细胞数一着色细胞数）÷总细胞数×100%。
【注意事项】
1．如果含有台盼蓝的细胞悬液放置时间过长，正常细胞可摄取染料，从而影响染色结果。
2．台盼蓝染色法是一种粗略的检测存活细胞的方法，不能准确地反映细胞活性的差异。因此，应使用MIT比色法或凋亡检测法评价细胞活性或检测早期凋亡细胞。
三、MTT比色法
MTT在不含酚红的培养液中溶解后呈黄色。活细胞线粒体中唬拍酸脱氢酶能将MTT黄色溶液还原为紫色的不可溶性甲攒结晶，沉积于细胞中。酸性异丙醇或DMSO可溶解甲攒结晶，用酶联免疫检测仪测定吸光度值，判断细胞的代谢水平。MTT比色法用于生物活性因子的活性检测、细胞毒性实验、抗肿瘤药物筛选和肿瘤放射敏感性测定等。
【材料】
1. MTT溶液5g/L，用不含酚红的培养液或0. 0l mol/L PBS (pH7. 2 )配制。在磁力搅拌器上搅拌30分钟，用0. 22 μm微孔滤器过滤除菌。然后，放2一8℃冰箱内避光保存。如需较长时间使用，可冷冻保存。
2．异丙醇溶液或DMSO异丙醇溶液用0.04－0. 1mol/L盐酸配制。
3．振荡混合仪和酶联免疫检测仪。
【操作程序】
1．在96孔培养板中培养细胞，取待检细胞，吸去培养液，按100一200μl/孔加入含有10% MTT的培养液，继续培养3一4小时。
2．吸去含有MTT的培养液，加入与培养液相同量的异丙醇溶液或DMSO。然后，振荡10分钟，使结晶充分溶解。对于悬浮生长细胞，离心（1000r/min, 5分钟），吸去培养液，再加入异丙醇溶液或DMSO。
3．在酶联免疫检测仪上测定吸光度值，测定波长为490nm，参考波长630一690nm。以只加培养液的培养皿为空白对照组。
【结果分析】细胞存活率＝试验组吸光度值÷对照组吸光度值×100%。
【注意事项】
1．高浓度血清可影响吸光度值。常使用含10% FBS的培养液，在加入异丙醇溶液或DMSO前尽量吸净培养液。
2．吸去培养液时，动作要慢，以免吸去甲臢结晶。
四、细胞生长曲线法
细胞生长曲线法是观察同一代细胞的增殖过程。根据细胞生长曲线分析细胞增殖速度，确定具体实验、细胞传代、细胞冻存或具体实验的*佳时间。
【材料】
1. 24孔培养板。
2．细胞悬液。
3．消化液0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA混合消化液。
［操作程序】
1．计算细胞密度2次，得出细胞密度平均值。然后，将细胞悬液等量加入培养板的每个孔中，培养时间计为0。
2．每隔24小时吸去3个孔的培养液，加入消化液，混悬细胞，计算细胞数目。每个孔计数2次，得出细胞密度平均值。
3．绘细胞生长曲线，横坐标为培养时间，纵坐标为细胞密度。
【结果分析】
1．细胞生长曲线反映细胞的生物学特征。每一代细胞的生长过程可大致分为潜伏期、指数生长期和停滞期。
(1) 潜伏期：细胞对分离和传代操作所致损伤的恢复以及适应新生长环境的过程。一般来说，原代培养细胞需要24一96小时，甚至更长时间才能恢复增殖。不同细胞的增殖恢复所需时间不同，如肿瘤细胞比正常二倍体细胞恢复得快。传代细胞的潜伏期一般为6一24小时。
(2) 对数生长期：细胞数量呈对数增长。对数生长期一般为3一5天。常以倍增时间来表示细胞生长旺盛情况，倍增时间为细胞数量增加一倍所需要的时间。
(3）停滞期：除肿瘤细胞和成纤维细胞外，细胞*后长满形成单层。细胞不再增殖，生长活动停滞。
2．不同种类细胞的生长曲线各具有特点。
【注意事项】
1．培养板各孔内细胞的消化操作过程要一致，避免得出的细胞密度有明显差别。
2．计数细胞前，应尽量使细胞混悬均匀。
五、［3H］-TdR掺入法
将用[3H]标记的胸腺嗜 pQ脱氧核苷掺入到新合成的DNA中，通过测定［3H]放射性脉冲数比较不同细胞的增殖活性。
【材料】
1．仪器液闪计数器。
2．标记物5 μCi［methyl- 3 H］-TdR/ml，用培养液配成。
3．清洗液PBS。
4．消化液0.25%胰蛋白酶和0. 02% EDTA混合消化液。
【操作程序】
1．将细胞悬液加入培养皿或培养板孔中，培养24一48小时。
2．吸去培养液，加入含有［3H]-TdR的新鲜培养液，培养12一24小时。
3．用PBS清洗细胞2次。
4．消化和收集细胞。
5．用预冷的10％三氯乙酸沉淀DNA，再用0.5 ml 1N NaOH提取。然后，用0.5m1 1N HCl中和NaOH。
6．用孔径为0. 2 FLm滤器或玻璃纤维滤纸滤出DNA提取物，烘干。
7．用液闪计数器测定每分钟放射性脉冲数。
【结果分析】被标记的细胞是处于分裂周期S期的细胞。[ 3 H ] -TdR掺入量反映DNA合成的快慢。
六、BrdU掺入法
细胞将BrdU磷酸化形成BrdUTP, BrdUTP作为前体掺入DNA，代替dTTP。
【材料】
1．仪器细胞计数器。
2．标记物20μmol BrdU /L，用培养液配成。
3．清洗液PBS。
4. PB液 含100mmo1/L KCH3COOH、30mmol/L KC1、l0mmol/L Na2 HPO4、1 mmol/L MgC12、1 mmol/L Na2ATP和1 mmol/ L DTT。
5．抗体稀释液含有0. 5% BSA和0.1%Triton 20的PBS。
【操作程序】
1. BrdU掺入
（1) 贴壁细胞：
1) 培养皿中放一块盖玻片，然后加入细胞悬液，培养24一48小时。
2）待细胞覆盖盖玻片约50％时，吸去培养液，加入含BrdU的培养液，继续培养15分钟。
(2) 悬浮细胞：
1）将0. 25g低凝点琼脂糖加入10m1 PBS，加热至95℃，溶解后冷却至37℃。
2）将1 ml 37℃的琼脂糖溶液与4ml 37℃的细胞悬液混合。
3) 加入10ml 37℃的石蜡，封好烧瓶，立即用手摇动10一15秒，呈现乳白色为止。
4）在预冷的水中间歇地摇动烧瓶，冷却10分钟，使琼脂糖在石蜡中形成胶状。
5) 加入35ml预冷的PBS,混合后离心（1000r/min, 5分钟）。然后吸去上清液，用PBS混悬琼脂糖包裹的细胞，再离心1次。
6) 用培养液混悬胶化细胞，培养1小时。
7) 吸去培养液，加入含BrdU的培养液，继续培养巧分钟。
2．固定
(1) 盖玻片上的细胞：
1) 配制4％甲醛：将4g低聚甲醛加入50ml蒸馏水中，加热至60℃，直到溶解。冷却后，加入50ml 2℃PBS，用孔径为0. 22μm的滤器过滤。
2）用PBS浸洗细胞2次，将盖玻片放入甲醛溶液，室温下放置10分钟。
3) 用PBS洗盖玻片2次后，再用0. 2% TritonX-100透化细胞5分钟。
(2) 胶囊包埋的细胞：
1) 按上述方法用PB液配制4％甲醛。
2）用预冷的PB液浸洗胶化细胞3次，每次5分钟。然后，在0℃条件下用0. 2% Triton X-100透化细胞10分钟。
3) 用预冷的PB浸洗细胞3次，每次5分钟，然后用甲醛溶液固定10分钟。
3．抗体标记
(1) 盖玻片上的细胞：
1) 用蒸馏水清洗盖玻片3次，然后用2mo1/LHCl处理细胞1小时，使DNA变性。
2）用0. 1 moUL Na2B4O7中和变性的DNA，再用PBS清洗细胞2次。
3）加入一抗，室温下放置1一2小时。
4）用抗体稀释液浸洗3次，每次10分钟。
5) 加入二抗，室温下放置1一2小时。
6）封片。
(2）胶囊包埋的细胞：
1) 用预冷的抗体稀释液清洗细胞2次。
2）取100μm细胞，加入400μm含有一抗的抗体稀释液，混合后在0℃条件下放置2小时，按时搅拌。
3）用预冷的抗体稀释液清洗细胞3次，每次10分钟。
4）加入400μm含有二抗的抗体稀释液，与细胞混合后于0℃条件下放置2小时，按时搅拌。
5）用预冷的抗体稀释液清洗3次，每次10分钟。
6) 在室温下用PBS清洗3次，每次5分钟。
7) 将5 μl细胞与等量封片剂混合，封片。
【结果分析】
1. BrdU被掺入到DNA复制位点，这些复制位点可用荧光剂或酶偶联的抗体检测。
2．计数染色细胞，得出有丝分裂指数。有丝分裂指数是指分裂象细胞占全部细胞的百分比。一般细胞的有丝分裂指数为0.1％一0.5%。细胞系和肿瘤细胞的指数较高，可达3％一5%。继代培养细胞的指数比原代细胞高。
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