人αN已酰葡糖苷酶(αNAG）elisa试剂盒@操作说明检测原理

试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被αN已酰葡糖苷酶(αNAG）抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并洗涤。用底物TMB显色，TMB在化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成终的黄色。颜色的深浅和样品中的αN已酰葡糖苷酶(αNAG）呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。

样品收集、处理及保存方法

1.血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20 分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

2.血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃ 1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

3.组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

4.细胞培养物上清：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

5.其它生物标本：1000×g离心20分钟，取上清即可检测。

6.样品外观：样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。

7.样品保存：样品收集后若在1周内进行检测的可保存于4℃，若不能及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃（1个月内检测），或-80℃（6个月内检测），避免反复冻融，标本溶血会影响检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。

自备物品

1. 酶标仪（450nm）

2. 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒温箱

人αN已酰葡糖苷酶(αNAG）elisa试剂盒@操作说明操作步骤：

1．从室温平衡60min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2．设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL。

3．样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。样本如需稀释，按照要求用试剂盒配套样本稀释液稀释样本。

4．每孔加入生物素标记抗体50μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育30min；标准孔空白孔不加！

5．弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6．除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育30min。

7．弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

8．每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

9．每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

实验计算结果

绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。

人αN已酰葡糖苷酶(αNAG）elisa试剂盒@操作说明性能

1.  准确性：标准品线性回归与预期浓度相关系数R值，大于等于0.9900。

2.  灵敏度：检测浓度小于1.0 pg/mL。

3.  特：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4.  重复性：板内、板间变异系数均小于15%。

5.  贮藏：2-8℃，避光防潮保存。

6.  有效期：6个月

技术小提示

1.当混合或重溶蛋白溶液时，尽量避免起沫。

2.为了避免交叉感染，配置不同浓度标准品、上样、加不同试剂都需要更换枪头。另外不同试剂请分别使用不同的移液槽。

3.每次孵育时，请正确使用封板胶可结果的准确性。

4.混合后的显色底物在上板应为无色，请避光保存；假如微孔板后，将由物色变成不同深度的蓝色。

5.终止液上板顺序应同显色底物上板顺序一致；加入终止液后，孔内颜色由蓝变黄；若孔内有绿色，则表明孔内液体未混匀；请充分混合。

人αL岩藻糖苷酶(AFU）elisa试剂盒@产品简介

原创作者：上海臻科生物科技有限公司