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森贝伽教您TUNEL细胞凋亡试剂盒参考操作步骤
点击次数：331 发布时间：2018/8/17
一、TUNEL细胞凋亡试剂盒内容 凋亡细胞的原位末断转移酶标记法（TUNEL法） 细胞凋亡的多步骤机制作用的*终环节是：细胞内源性核酸内切酶的激活而导致核染色质DNA双链的断裂。大量DN片段暴露出的3’-羟基在末断转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT)或DNA多聚酶的作用下，与生物素或高辛标记的核苷酸结合，*终借助与卵白素或抗高辛抗体结合的荧光素或HRP，使凋亡细胞被特异性地标记和显示出来。
TUNEL细胞凋亡试剂盒由Roche公司提供
试剂1： 酶浓缩溶液（Enzyme Solution），10×浓缩液；
试剂2： 标记溶液（Lable Solution），1×浓缩液；
试剂3： 转化剂-POD（Converter-POD），酶标记抗荧光素抗体（即用型）。
自备试剂：
PBS、 双蒸水、 二甲苯、 梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、 DAB工作液（临用前配制，5 μl 20×DAB+1μL 30%H2O2+94 μl PBS）、 Proteinase K工作液（10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl， pH 7.4-8）或细胞通透液（0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate，临用前配制）、 苏木素或甲基绿、 DNase 1（3000 U/ml－3 U/ml in 50 mM Tris-HCl，pH 7.5，10 mM MgCl2，1 mg/ml BSA）等。
操作流程图：制作石蜡切片→脱蜡、水合→细胞通透→加TUNEL反应液→加converter-POD→与底物DAB反应显色→光学显微镜计数并拍照。
- TUNEL细胞凋亡试剂盒参考操作步骤：
- 用二甲苯浸洗2次，每次5min；
- 用梯度乙醇（100、95、90、80、70%）各浸洗1次，每次3min；
- PBS漂洗2次；
- 用Proteinase K工作液处理组织15-30 min 在21–37°C（温度、时间、浓度均需摸索）或者加细胞通透液8min；
- PBS漂洗2次；
- 制备TUNEL反应混合液，处理组用50μl TdT+450μl 荧光素标记的dUTP液混匀；而阴性对照组仅加50μl 荧光素标记的dUTP液，阳性对照组先加入100μl DNase 1，反应在15~25℃×10min，后面步骤同处理组。
- 玻片干后，加50μl TUNEL反应混合液（阴性对照组仅加50μl 荧光素标记的dUTP液）于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×1h。
- PBS漂洗3次；
- 可以加1滴PBS在荧光显微镜下计数凋亡细胞（激发光波长为450~500nm，检测波长为515~565nm）；
- 玻片干后加50μl converter-POD于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×30min。
- PBS漂洗3次；
- 在组织处加50~100μl DAB底物，反应15~25℃×10min；
- PBS漂洗3次；
- 拍照后再用苏木素或甲基绿复染，几秒后立即用自来水冲洗。梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。
- 加一滴PBS或甘油在视野下，用光学显微镜观察凋亡细胞（共计200~500个细胞）并拍照。可结合凋亡细胞形态特征来综合判断（未染色细胞变小，胞膜完整但出现发泡现象，晚期出现凋亡小体，贴壁细胞出现邹缩、变圆、脱落；而染色细胞呈现染色质浓缩、边缘化，核膜裂解，染色质分割成块状/凋亡小体）。
- 注意事项
- 进行PBS 清洗时，每次清洗5 min。
- PBS清洗后，为了各种反应的有效进行，请尽量除去PBS 溶液后再进行下一步反应。
- 在载玻片上的样本上加上实验用反应液后，请盖上盖玻片或保鲜膜，或在湿盒中进行，这样可以使反应液均匀分布于样本整体，又可以防止反应液干燥造成实验失败。
- TUNEL反应液临用前配制，短时间在冰上保存。不宜长期保存，长期保存会导酶活性的失活。
- 如果20×DAB 溶液颜色变深成为紫色，则不可使用，需重新配制。
- 用甲基绿（Methyl Green）染液（3-5%甲基绿溶于0.1M 醋酸巴比妥 pH4.0）染色后，请用灭菌蒸馏水清洗多余的甲基绿。然后进行洗净（100%乙醇）、脱水（二甲苯）透明、封片后通过光学显微镜观察操作。如果此时使用80~90%的乙醇洗净时，甲基绿比较容易脱色，注意快速进行脱水操作。
- 荧光素标记的dUTP液含甲次酸盐和二氯钴等致癌物，可通过吸入、口服等途径进入机体，注意防护。
- 试剂保存：未打开的试剂盒贮存在-20℃（-15~25℃）；converter -POD液一旦解冻，以后就保存在4℃（2~8℃）下，至少在6 个月内稳定，避免再次冻存；TUNEL反应液临用前配好后，放至冰上直至使用。
9. 结果分析时注意：在坏死的晚期阶段或在高度增殖/代谢的组织细胞中可产生大量DN片断，从而引起假阳性结果；而有些类型的凋亡性细胞死亡缺乏DNA断裂或DNA裂解不完全，以及细胞外的矩阵成分阻止TdT进入胞内反应，进而产生假阴性结果。
