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技术文章
猪蓝耳病毒PCR检测试剂盒操作说明
点击次数：4343 发布时间：2018/9/6 22:10:01
【产品名称】
通用名称：猪蓝耳病毒检测试剂盒（实时荧光PCR法）
英文名称： Porcine Reproductive ａnd Respiratory Syndrome Virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包装规格】25T/盒 & 50T/盒
【预期用途】
本试剂盒利用实时荧光PCR原理，定性检测猪蓝耳病病毒，对猪蓝耳病病毒的诊断及疗效评估有重要指导意义。
【检验原理】
本试剂盒针对猪蓝耳病毒的高度保守区域设计特异性引物和探针，在反应体系中含猪蓝耳病毒基因组模板的情况下，PCR反应得以进行并释放荧光信号。利用荧光定量PCR仪对PCR过程中相应通道信号进行实时监测和输出，实现检测结果的定性分析。
【主要组成成份】
| 序号 | 组成 | 25T/盒 | 50T/盒 |
| 1 | PRRSV RT-PCR反应液 | 375 μL×1管 | 750 μL×1管 |
| 2 | PRRSV逆转录酶 | 50 μL×1管 | 100 μL×1管 |
| 3 | PRRSV Taq酶 | 75 μL×1管 | 150 μL×1管 |
| 4 | PRRSV阳性对照 | 40 μL×1管 | 40 μL×1管 |
| 5 | PRRSV阴性对照 | 40 μL×1管 | 40 μL×1管 |
| 6 | 说明书 | 1份 | 1份 |
注：阴性对照为猪基因组DNA，阳性对照为失去活性的猪蓝耳cDNA。
【储存条件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反复冻融，有效期12个月。
【适用仪器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道实时荧光定量PCR仪。
【样本要求】
1.血液或血清样品：使用无菌注射液抽取样品置于离心管中待检。
2.肺脏、淋巴结和脾脏样品：取样本20 g，加少量灭菌PBS，用无菌研磨器研磨至糊状，再用4倍体积的PBS稀释成乳剂，8000 rpm 4℃离心10 min，取上清待检。
3.应避免标本间交叉污染。
4.样本收集后可立即检测；若不能立即检测，可置于2～8℃冷藏过夜保存；如需长期保存，标本应冻存于-80℃以下，避免反复冻融。。
【检验方法】
1. 试剂准备（试剂准备区）
（1）从冰箱中取出试剂盒, 从试剂盒中取出实验所需试剂，充分融化混匀并瞬时离心以去除管壁附着液体。
（2）核算当次实验所需要的反应数（n），并根据如下表所示反应体系计算当次实验所需要的各种试剂量。
n =阴性对照数（1T）+阳性对照数（1T）+误差预留量（1T）+样本数
| 单反液配制表(每份) | RT-PCR反应液 | 15.0 μL |
| 逆转录酶 | 2.0 μL | |
| Taq酶 | 3.0 μL |
(3)在无菌离心管中加入上述试剂，充分混匀后瞬时离心。按照20μL/管分装量将试剂分装至PCR反应管。
2.样本准备（样本处理区）
用QIAGEN、Roche公司RNA提取试剂盒提取RNA，具体操作按照其试剂盒说明书操作。
3.加样
在上述制备好的PCR反应样本管中分别加入处理好的待测标本RNA各5 μL、终体积25 μL/管，盖好PCR反应盖混匀后瞬时低速离心，转移到PCR仪器上。阴性对照和阳性对照管则各加5 μL试剂盒自带的阴性对照或阳性对照品，终体积为25 μL/管，盖好PCR反应盖混匀后瞬时低速离心，转移到PCR仪器上。
4.PCR（PCR扩增区）
（1）取样本处理区准备好的PCR反应管，放置在实时荧光定量PCR仪样品槽相应位置，并记录放置顺序。
（2）按下表设置仪器核酸扩增相关参数进行PCR扩增。
| 反应体积 | 25μL | 通道选择 | FAM通道采集猪蓝耳病毒信号 |
| PCR 反应 条件 | 步骤 | 条件 | 循环数 |
| 反转录 | 42℃：10分钟（min） | 1 | |
| 预变性 | 95℃：3分钟（min） | 1 | |
| 预扩增 | 95℃：5秒（s） | 5 | |
| 55℃：40秒（s） | |||
| PCR扩增 | 95℃：5秒（s） | 40 | |
| 55℃：40秒（s） （此阶段结束时采集荧光信号） |
【参考值（参考范围）】
1.试剂盒有效性判定：
（1）阳性对照：有典型S型扩增曲线或Ct值≤35。
（2）阴性对照：Ct值＞38或无Ct值，线形为直线或轻微斜线，无指数增长期。
2.标本结果判定：
（1）阳性：标本检测结果Ct值≤35或有明显指数增长期。
（2）可疑：标本检测结果Ct值在35～38范围内。此时应对标本进行重复检测，如重复实验结果Ct值仍在35～38范围内，有明显指数增长期，则判定为阳性，否则为阴性。
（3）阴性：标本检测结果Ct值＞38或无Ct值。
【检验结果的解释】
| 通道及检测结果 | 标本检测结果解释 |
| FAM | |
| 阴性（－） | 标本中未检出猪蓝耳病毒RNA |
| 阳性（＋） | 标本中检测出猪蓝耳病毒RNA |
【检验方法的局限性】
1. 当检测样本中被检核酸浓度低于本试剂盒的检出限时可能会发生假阴性的结果。
2. 被检样本在采集、运输、储存以及处理过程中操作方式不当容易造成RNA降解而产生假阴性结果。
3. 样本在采集、运输、储存以及处理过程中发生交叉污染，则容易得到假阳性结果。
【产品性能指标】产品的检出限为102 Copies/mL，产品CV值≤5%。
【注意事项】
1. 整个检测过程应严格按照本说明书要求分别在试剂准备区、样本处理区和PCR扩增区进行操作，各区实验服、仪器、耗材应独立使用，不能混用；实验用吸头采用带滤芯吸头；样本处理区应配有生物安全柜，样本处理在生物安全柜中进行操作；三个区应该配有紫外线杀菌装置。
2. 为避免RNA降解，样本处理过程应在0-4℃条件下操作，且完成实验后立即上机检测；样本处理过程中使用的器具耗材应经过无核酶处理。
3. 每次实验应该设置阴、阳性对照。
4. 试剂盒所有试剂在使用前应该在常温下充分融化混匀，并应瞬时离心。
5. 试剂盒内所配阴性和阳性对照在次使用前应全部转移至标本准备区，并单独存放。
6. 为防止荧光干扰，应避免裸手直接接触PCR反应管，并应避免在PCR反应管上进行任何标记。
7. 仪器扩增相关参数应按照本说明书相关要求进行设置；不同批号试剂不能混用。
8. ABI系列荧光定量PCR仪参数设置中不选ROX校正，淬灭基因选择None。
9. 实验过程中产品的废弃物应该进行无害化处理后方可丢弃。
原创作者：上海臻科生物科技有限公司
