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技术文章
多聚甲醛固定美丽线虫体法
点击次数：653 发布时间：2011/3/24 18:15:35
虫体的第二种常用的固定方法是使用多聚甲醛。此法比上述的Bouin固定法温和，但通常需要使用胶原酶。这种方法尤其适用于检测成虫。
1．所需的溶液和试剂
4％多聚甲醛（新鲜配制，见附录Ⅳ）；
含1％NP—40， 200mmol／L二硫基苏糖醇（DTT）的20mm01／L硼酸钠（pH9．6）；
含1％NP一40的PBS；
含50％甲醇，20mmol／LEDTA， 10mmol／L亚精胺盐酸的PBS。
2．操作步骤
（1）用含0．05％NP—40的PBS（4℃）洗平皿的表面，以去除幼虫的生长介质。将全部液体转入一支15m1锥形管中。
（2）以200g离心1min。去除上清。将虫体转至另一1．5m1锥形管中，加入lml含0．05％NP一40的PBS（4℃）。
在固定液中的时间长短可影响不同抗原抗体结合的能力。根据所进行的实验应经过预试建立一个
*佳的固定时间。
（3）以200g离心10s。尽可能将上清完全去除。
（4）加50／ll含50％甲醇、20mmol／LEGTA和10mmol／L亚精胺盐酸的PBS， 以及500／1l 4％多聚甲醛（新鲜配制，见附录Ⅳ）。将此管浸入液氮中快速冷冻。取出后在流动的温水中使其融化。随后再浸入液氮中。如上述一样在流动的温水中融化。
固定的虫体从液氮取出后，在—70℃可以至少保存一年。
（5）在4℃孵育1～24h。
（6）用含0．05％NP—40的PBS（4℃）洗涤虫体2次。
（7）离心，并去除*后的洗液。重悬于含1％NP-40，100mmol／L DIT的20mm01／L硼酸钠（pH9．6）中。在室温下孵育2ho
如果使用阶段幼虫的样本，在孵育过程中还需要多冻融（同步骤4）2次，以增强透化处理。
（8）用含0．05％NP一40的PBS（4℃）洗3次。
（9）在含0．3％过氧化氢的20mmol／L硼酸钠（pH9．6） （新鲜配制）中孵育15min。
（10）用含0．05％NP—40的PBS（4℃）洗3次。
至此，样品可以加入抗体进行染色。
原创作者：杭州旺森科技有限公司
