超微量分光光度计常见的用途

 

分光光度计是一类很重要的分析仪器　，无论在物理学、化学、生物学、医学、材料学、环境科学等科学研究域　，还是在化工、医药、环境检测、冶金等现代生产与管理部门　，紫外可见分光光度计督有广泛而重要的应用。分光光度计就是利用分光光度法对物质进行定量定性分析的仪器，常用于核酸，蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。

 

超微量分光光度计已成为现代分子生物实验室常规仪器。常用于核酸，蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。

 

核酸的定量

 

核酸的定量是超微量分光光度计使用频率功能。可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链ＤＮＡ，以及ＲＮＡ。核酸的吸收峰的吸收波长２６０　ｎｍ。每种核酸的分子构成不一，因此其换算系数不同。定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。如：１ＯＤ　的吸光值分别相当于５０μｇ／ｍｌ的ｄｓＤＮＡ，３７μｇ／ｍｌ的ｓｓＤＮＡ，４０μｇ／ｍｌ的ＲＮＡ，３０μｇ／ｍｌ的Ｏｌｉｇ。测试后的吸光值经过上述系数的换算，从而得出相应的样品浓度。测试，选择正确的程序，输入原液和稀释液的体积，尔后测试空白液和样品液。然而，实验并非一帆风顺。读数不稳定可能是实验者头痛的问题。灵敏度越高的仪器，表现出的吸光值漂移越大。

 

事实上，分光光度计的设计原理和工作原理，允许吸光值在一定范围内变化，即仪器有一定的准确度。如德国伯赫Ｃｏｌｉｂｒｉ超微量分光光度计的准确度≤１．０％（１Ａ）。这样多次测试的结果在均值１．０％左右之间变动，都是正常的。另外，还需考虑核酸本身物化性质和溶解核酸的缓冲液的ｐＨ值，离子浓度等：在测试时，离子浓度太高，也会导致读数漂移，因此建议使用ｐＨ值一定、离子浓度较低的缓冲液，如ＴＥ，可大大稳定读数。样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素：由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒，尤其是核酸样品。这些小颗粒的存在干扰测试效果。为了程度减少颗粒对测试结果的影响，要求核酸吸光值至少大于０．１Ａ，吸光值在０．１－１．５Ａ。在此范围内，颗粒的干扰相对较小，结果稳定。从而意味着样品的浓度不能过低，或者过高（超过光度计的测试范围）。是操作因素，如混合要充分，否则吸光值太低，甚至出现负值；混合液不能存在气泡，空白液无悬浮物，否则读数漂移剧烈；必须使用相同的比色杯测试空白液和样品，否则浓度差异太大；换算系数和样品浓度单位选择一致；不能采用窗口磨损的比色杯；样品的体积必须达到比色杯要求的小体积等多个操作事项。

 

除了核酸浓度，分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示样品的纯度，如Ａ２６０／Ａ２８０的比值，用于评估样品的纯度，因为蛋白的吸收峰是２８０ｎｍ。纯净的样品，比值大于１．８（ＤＮＡ）或者２．０（ＲＮＡ）。如果比值低于１．８　或者２．０，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。Ａ２３０表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，较纯净的核酸Ａ２６０／Ａ２３０的比值大于２．０。Ａ３２０检测溶液的混浊度和其他干扰因子。纯样品，Ａ３２０一般是０。

 

蛋白质直接定量

 

这种方法是在２８０ｎｍ波长，直接测试蛋白。选择Ｗａｒｂｕｒｇ　公式，光度计可以直接显示出样品的浓度，或者是选择相应的换算方法，将吸光值转换为样品浓度。蛋白质测定过程非常简单，先测试空白液，然后直接测试蛋白质。由于缓冲液中存在一些杂质，一般要消除３２０ｎｍ　的“背景”信息，设定此功能“开”。与测试核酸类似，要求Ａ２８０的吸光值至少大于０．１Ａ，线性范围在１．０－１．５　之间。实验中选择Ｗａｒｂｕｒｇ　公式显示样品浓度时，发现读数“漂移”。这是一个正常的现象。事实上，只要观察Ａ２８０的吸光值的变化范围不超过１％，表明结果非常稳定。漂移的原因是因为Ｗａｒｂｕｒｇ　公式吸光值换算成浓度，乘以一定的系数，只要吸光值有少许改变，浓度就会被放大，从而显得结果很不稳定。蛋白质直接定量方法，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说，速度快，操作简单；但是容易受到平行物质的干扰，如ＤＮＡ的干扰；另外敏感度低，要求蛋白的浓度较高。

 

比色法蛋白质定量

 

蛋白质通常是多种蛋白质的化合物，比色法测定的基础是蛋白质构成成分：氨基酸（如酪氨酸，丝氨酸）与外加的显色基团或者染料反应，产生有色物质。有色物质的浓度与蛋白质反应的氨基酸数目直接相关，从而反应蛋白质浓度。

 

比色方法一般有ＢＣＡ，Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｌｏｗｒｙ　等几种方法。

 

Ｌｏｗｒｙ　法：以早期的Ｂｉｕｒｅｔ　反应为基础，并有所改进。蛋白质与Ｃｕ２　反应，产生蓝色的反应物。但是与Ｂｉｕｒｅｔ　相比，Ｌｏｗｒｙ　法敏感性更高。缺点是需要顺序加入几种不同的反应试剂；反应需要的时间较长；容易受到非蛋白物质的影响；含ＥＤＴＡ，Ｔｒｉｔｏｎ　ｘ－１００，ａｍｍｏｎｉａ　ｓｕｌｆａｔｅ　等物质的蛋白不适合此种方法。

 

ＢＣＡ（Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｎｅ　ａｃｉｄ　ａｓｓａｙ）法：这是一种较新的、更敏感的蛋白测试法。要分析的蛋白在碱性溶液里与Ｃｕ２　反应产生Ｃｕ　，后者与ＢＣＡ形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在５６２ｎｍ波长。此化合物与蛋白浓度的线性关系强，反应后形成的化合物非常稳定。相对于Ｌｏｗｒｙ法，操作简单，敏感度高。但是与Ｌｏｗｒｙ法相似的是容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。

 

Ｂｒａｄｆｏｒｄ　法：这种方法的原理是蛋白质与考马斯亮兰结合反应，产生的有色化合物吸收峰５９５ｎｍ。其特点是，敏感度好，是Ｌｏｗｒｙ　和ＢＣＡ　两种测试方法的２　倍；操作更简单，速度更快；只需要一种反应试剂；化合物可以稳定１小时，方便结果；而且与一系列干扰Ｌｏｗｒｙ，ＢＣＡ　反应的还原剂（如ＤＴＴ，巯基乙醇）相容。但是对于去污剂依然是敏感的。主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比性。

 

某些初次接触比色法测定的研究者可能为各种比色法测出的结果并不一致，感到迷惑，究竟该相信哪种方法？由于各种方法反应的基团以及显色基团不一，所以同时使用几种方法对同一样品得出的样品浓度无可比性。例如：Ｋｅｌｌｅｒ等测试人奶中的蛋白，结果Ｌｏｗｒｙ，ＢＣＡ　测出的浓度明显高于Ｂｒａｄｆｏｒｄ，差异显著。即使是测定同一样品，同一种比色法选择的标准样品不一致，测试后的浓度也不一致。如用Ｌｏｗｒｙ测试细胞匀浆中的蛋白质，以ＢＳＡ作标准品，浓度１．３４ｍｇ／ｍｌ，以ａ球蛋白作标准品，浓度２．６４ｍｇ／ｍｌ。因此，在选择比色法之，是参照要测试的样本的化学构成，寻找化学构成类似的标准蛋白作标准品。另外，比色法定量蛋白质，经常出现的问题是样品的吸光值太低，导致测出的样品浓度与实际的浓度差距较大。关键问题是，反应后１０１１分光光度计的重要配件——　比色杯的颜色是有一定的半衰期，所以每种比色法都列出了反应测试时间，所有的样品（包括标准样品），都必须在此时间内测试。时间过长，得到的吸光值变小，换算的浓度值降低。除此，反应温度、溶液ＰＨ值等都是影响实验的重要原因。此外，非常重要的是，是用塑料的比色法。避免使用石英或者玻璃材质的比色杯，因为反应后的颜色会让石英或者玻璃着色，导致样品吸光值不准确。

 

ＯＤ　６００

 

实验室确定细菌生长密度，多根据经验和目测推断细菌的生长密度。在遇到要求较高的实验，需要采用分光光度计准确测定细菌细胞密度。ＯＤ６００是追踪液体培养物中微生物生长的标准方法。以未加菌液的培养液作为空白液，之后定量培养后的含菌培养液。为了正确操作，必须针对每种微生物和每台仪器用显微镜进行细胞计数，做出校正曲线。实验中偶尔会出现菌液的ＯＤ值出现负值，原因是采用了显色的培养基，即细菌培养一段时间后，与培养基反应，发生变色反应。另外，需注意的是，测试的样品不能离心，保持细菌悬浮状态。

 

超微量分光光度计的主要结构

 

各种型号的分光光度计基本结构都相同，由如下五种部分组成：

 

１）光源（钨灯、卤钨灯，氢弧灯，氘灯、氙灯或激光光源）；

 

２）单色器（滤光片、棱镜、光栅、全息栅）；

 

３）样品吸收池；

 

４）检测系统（光电池、光电管、光电倍增管）；

 

５）信号指示系统（检流计、微安表、数字电压表、示波器、微处理机显像管）。

 

光源－单色器－样品吸收池－检测系统－信号指示系统。

 

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