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技术文章
NADPH-细胞色素c还原酶(NCR)试剂盒说明书
点击次数：215 发布时间：2019/5/31 8:52:40
一、测定意义：
细胞色素P450酶是一组主要存在于肝脏的同工酶,在外源物质代谢中具有重要作用,尤其是
药物和毒物的代谢。NCR作为P450酶系的重要一员，催化氧化型P450还原再生。
二、测定原理：
NCR催化NADPH还原氧化型细胞色素c，还原型细胞色素c在550nm处有独特吸收峰；通过
测定550nm吸光度的增加速率，来计算NCR活性。
三、需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、普通离心机、超速离心机、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿和蒸馏水
四、试剂的组成和配制：
试剂一：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入100mL 蒸馏水充分溶解。
试剂二：液体×1 瓶，4℃保存。
试剂三：粉剂×1 瓶，-20℃保存；临用前加入2.60mL 蒸馏水充分溶解，4℃保存。
试剂四：粉剂×1 瓶，4℃保存；临用前加入550μL 蒸馏水充分溶解，4℃保存。
五、粗酶液提取：
① 称取约0.5g组织，加入4℃预冷的1mL试剂一，冰上充分研磨，10,000g，4℃离心30min，
取上清液转移到超速离心管中；
② 在4℃，100,000g离心60min，弃上清液；
③ 在沉淀中加入1mL试剂一，盖紧后充分震荡溶解，100,000g离心30min，弃上清液；
④ 向上步骤沉淀中加入0.5mL试剂二，盖紧后充分震荡溶解，4℃保存待测。
六、测定步骤：
1、 分光光度计预热30min 以上，调节波长至550nm，蒸馏水调零；
2、 试剂二在37℃水浴预热30min以上；
3、 样本测定
（1）空白管：取1mL玻璃比色皿，一次加入50μL蒸馏水、900μL试剂二、50μL试剂三和10μL
试剂四，迅速混匀后于550nm处分别测定第10s吸光值A1和第130s吸光值A2，计算ΔA空白 =A2-A1。
（2）测定管：取1mL玻璃比色皿，一次加入50μL粗酶液、900μL试剂二、50μL试剂三和10μL
试剂四，迅速混匀后于550nm处分别测定第10s吸光值A3和第130s吸光值A4；计算ΔA测定 =A4-A3。
注：当样本数量比较巨大时，只需要做一个空白管。
七、NCR 活力单位的计算
1、按照蛋白浓度的计算:
单位的定义：37℃反应条件下，每mg蛋白每分钟催化产生1nmol还原型细胞色素c定义为1U；
NCR（U/mg prot）＝（ΔA测定-ΔA空白）÷(ε×d)×V反总÷(Cpr×V样)÷T ＝ 529×（ΔA测定-ΔA空白）÷ Cpr
2、按样本质量计算:
单位的定义：37℃反应条件下，每g样品每分钟催化产生1nmol还原型细胞色素c定义为1U；
NCR（U/g）＝（ΔA测定-ΔA空白）÷(ε×d)×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T ＝ 265×（ΔA测定-ΔA空白）÷W
ε：还原型细胞色素c在550nm处摩尔吸光系数为1.91×10
4L/mol/cm=0.0191 L/μmol/cm；
上海雅吉生物科技有限公司 TEL:021-34661276 官网 www.yajimall.com d：比色皿光径（cm），1cm；
V反总：反应体系总体（L），1010μL=1.01×10
-3L；
Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司BCA 蛋白质含量测定
试剂盒；
V样：加入反应体系中上清液体积（mL），50μL=0.05mL；
V样总：加入提取液体积（mL），0.5mL；
T：催化反应时间（min），2min；
W：样本质量，（g）；
原创作者：上海雅吉生物科技有限公司
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