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技术文章
禽流感病毒 H1 亚型实时荧光 RT-PCR 检测试剂盒使用说明书
点击次数：224 发布时间：2019/6/3 9:01:08
【用途】
本试剂盒采用实时荧光 RT-PCR 方法检测禽
组织、分泌物、排泄物及尿囊液中禽流感病毒 H1
亚型（AIV-H1）的 RNA，适用于 AIV-H1 的检测、
诊断和流行病学调查。
【原理】
提取样品 RNA，在高效反转录酶的作用下，
以 RNA 为模板，以引物为起点合成与 RNA 模板
互补的 cDNA 链。在热启动 Taq 酶的作用下，经
高温变性、中温退火及延伸的循环，使特异 DNA
片段的拷贝数放大一倍，经荧光素标记的探针与
扩增的 DNA 杂交，利用 Taq 聚合酶的 5＇→3＇外切
活性，使荧光探针的报告基团与淬灭基团分离，
发出特异性荧光信号，利用荧光 PCR 仪检测特异
性荧光信号，根据样品 Ct 值的大小及扩增曲线的
形成情况判定结果。
【试剂盒组成】
组成 50 头份 贮藏条件
阴性对照 1 mL
-20℃
阳性对照 600 µL
无菌无核酸酶水 600 µL
RT-PCR 反应液 600 µL
酶混合液 24 µL
荧光探针 140 µL
说明书 1 份
【需要自备的器材】
1．试剂：核酸提取试剂。
可调移液器（2µL、20µL、200µL、1000µL）。
3．耗材：荧光 PCR 专用反应管、吸头（10µL、
200µL、1000µL）。
【使用注意事项】
1．建议与世纪元亨提供的柱式 RNA 核酸提取试
剂盒配套使用。
2．实验过程中进行阴性对照和阳性对照样品的
质量控制，需进行提取，建议提取用量分别为
100µL。
3．所有接触病料的物品均应合理处置，以免污染
实验室。
4．PCR 整个试验分配液区、模板提取区、扩增
区。流程顺序为配液区→模板提取区→扩增
区。严禁器材和试剂倒流。
5．所有试剂应在规定的温度储存。-20℃保存的
各试剂管使用前应完全融化，8000rpm 离心
15s，使液体全部沉于管底，放于冰盒中，吸
取液体时移液器吸头尽量在液体表面层吸取，
使用后立即放回-20℃。
6．注意防止试剂盒组分受污染。不要使用超过有
效期限的试剂，试剂盒之间的成分不要混用。
7．严格遵守操作说明可以获得的结果。操作
过程中移液、定时等全部过程必须精确。
8．反应体系应在特定配液区或者超净工作台中
配制，整个实验过程严格控制污染。
9．反复冻融试剂将减低检测灵敏度，本试剂盒应
在 3 次内用完。
【样品采集】
病死或扑杀禽，取喉气管、脑、胸肌、心肌
和肺等组织；待检活禽，用棉拭子取呼吸道分泌
物或排泄物，置于 50%甘油生理盐水中。2～8℃
保存，送实验室检测。（要求送检病料新鲜，严禁
反复冻融。）
【实时荧光 RT-PCR 操作】
设被检样品、阴性对照和阳性对照总和为 N，
则反应体系配制如下：
试剂 体系
无菌无核酸酶水 2.3×（N+1）µL
RT-PCR 反应液 10×（N+1）µL
酶混合液 0.4×（N+1）µL
荧光探针 2.3×（N+1）µL
将以上配制的反应体系充分混匀后，分装每
个反应管中各 15µL。分别取 5µL 模板 RNA，加
入相应反应管中，混匀并作好标记，在荧光 PCR
仪上进行以下反应：45℃ 15min，95℃ 1min；95℃
5s，60℃ 35s，在每个循环第二步（60℃ 35s）收
集荧光信号，共 40 个循环。（报告基团“FAM”，
淬灭基团“None”）。
【结果判定】
1 结果分析条件设定
阈值设定原则：阈值线设定于刚好超过阴性
对照扩增曲线的点。不同仪器可根据仪器噪
音情况进行调整。
2 结果描述及判定
阳性对照 Ct 值≤30 并出现特异性扩增曲线，
阴性对照无 Ct 值并且无特异性扩增曲线，实验结
果成立；被检样品 Ct 值≤30 并出现特异性扩增曲
线为 AIV-H1 阳性；被检样品 30＜Ct＜36 并出现
特异性扩增曲线，需重新取样提取 RNA，扩增后
进行结果判定，如仍是可疑，可判定为阳性；被
检样品 Ct 值≥36 时，超过本方法检测灵敏度范
围，判定为阴性；对于某些未呈现特异性扩增曲
线，但本底较高的样品，应判定为阴性。
【规格】50 头份/盒
【保存及有效期】于-20℃以下保存，有效期为 12
个月。
原创作者：上海雅吉生物科技有限公司
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