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技术文章
犬细小病毒 PCR 检测试剂盒使用说明书
原理 提取病料 DNA 作为模板，高温使模板的一条双链 DNA 变性后形成两条单链，低温使引物与
互补的模板形成双链，中温时，在 TaqDNA 聚合酶作用下，以 dNTP 为原料，以引物为复制的起点，沿 模板合成一条新链。每个循环包括：高温变性、低温退火、适温延伸三个过程。每一次循环使扩增的 DNA 片段拷贝数放大一倍。经过 35 次循环，使扩增的 DNA 片段放大了数百万倍。将扩增产物进行电 泳，经染色后，在紫外灯照射下，肉眼可见到 DNA 片段的扩增带。
试剂盒组成
| 名称 | 10 头份 | 50 头份 | 贮藏条件 |
| 0.2 mL 薄壁 PCR 管 | 15 个 | 60 个 |
室温（A 盒） |
| DNA 吸附柱和收集管 | 10 套 | 50 套 | |
| 消化液 | 2.4 mL | 11mL | |
| DNA 结合液 | 3.6 mL | 16mL | |
| DNA 洗涤液 | 12 mL | 52mL | |
| DNA 洗脱液 | 1 mL | 4 mL | |
| 矿物油 | 300 µL | 1.2 mL | |
| 50 倍 TAE 电泳缓冲液（50 倍稀释后使用） | 20 mL | 100 mL | |
| 染色液 | 20 µL | 50 µL | |
| 蛋白酶 K | 240µL | 1.1mL |
-20 ℃（B 盒） |
| 阴性对照 | 350 µL | 1 mL | |
| 阳性对照 | 350 µL | 1 mL | |
| PCR 反应液 | 200 µL | 1 mL | |
| Taq DNA 聚合酶 | 25 µL | 120 µL |
保存期本产品有效期为 6 个月。
需要自备的物品
1．仪器：分析天平、水浴锅、离心机、PCR 扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪（或紫外分 析仪）、微波炉、组织研磨器、-20 ℃冰箱、可调移液器（2 µL、20 µL、200 µL、1000 µL）。 2．耗材：眼科剪、眼科镊、称量纸、20 mL 一次性注射器、1.5 mL 灭菌离心管、琼脂糖、500 mL 量筒、500 mL 锥形瓶、吸头（10 µL、200 µL、1000 µL）、灭菌双蒸水。
注意事项
1．所有接触病料的物品均应合理处置，以免污染实验室。
2．PCR 整个试验分配液区、模板提取区、扩增区、电泳区。流程顺序为配液区→模板提取区→扩 增区→电泳区。严禁器材和试剂倒流。
3．所有试剂应在规定的温度储存。-20℃保存的各试剂管使用前应完全融化，8000 rpm 离心 15 s， 使液体全部沉于管底，放于冰盒中，吸取液体时移液器吸头尽量在液体表面层吸取，使用后立 即放回-20 ℃。
4． 消化液低温时可能出现结晶，请于 37 ℃温育，溶解至澄清透明后使用。
5． 染色液低毒，操作时应戴上手套，避光保存，较长时间不使用请存放于 4℃，以免挥发变干。 染色液和上样缓冲液使用前也请离心使液体沉于管底。
6．注意防止试剂盒组分受污染。不要使用超过有效期限的试剂，试剂盒之间的成分不要混用。
7．严格遵守操作说明可以获得的结果。操作过程中移液、定时等全部过程必须精确。
8．反复冻融试剂将减低检测灵敏度，建议在 3 次内用完，请严格按试剂盒说明书操作。
样品制备
1 样品采集：病死犬，取脑、心脏、肺脏等组织病变部与健康部交界处组织；待检病犬，用棉拭子 取排泄物，置于 50%甘油生理盐水中或者将粪便取到无菌的小青瓶中；待检病犬，用注射器取血 2mL。 2～8 ℃保存，送实验室检测。（要求送检病料新鲜，严禁反复冻融病料。）
2 样品处理：每份样品分别处理。
2.1 组织样品处理：每份组织分别从三个不同的位置称取样品约 1g，用手术剪剪碎混匀后取 0.05 g 于研磨器中研磨，加入 1.5 mL 生理盐水继续研磨，待匀浆后转至 1.5 mL 灭菌离心管中，8000 rpm 离心 2 min，取上清液 100 µL 于 1.5 mL 灭菌离心管中，再加入 200 µL 消化液和 20 µL 蛋白酶 K，
振荡混匀后，置 56 ℃水浴中消化 1 小时。
2.2 排泄物的处理：将排泄物振荡混匀或取粪便约 0.05 g 到离心管中加入 1.5 mL 生理盐水振荡混匀，
8000 rpm 离心 2 min，取上清液 100 µL 于 1.5 mL 灭菌离心管中，再加入 200 µL 消化液和 20 µL 蛋
白酶 K，振荡混匀后，置 56 ℃水浴中消化 1 小时。
2.3 全血样品处理：待血凝后取血清 100 µL，加入 200 µL 消化液和 20 µL 蛋白酶 K，振荡混匀后，
置 56 ℃水浴中消化 1 小时。
2.4 阳性对照处理：取阳性对照 100 µL，加入 200 µL 消化液和 20 µL 蛋白酶 K，振荡混匀后，置 56 ℃
水浴中消化 1 小时。
2.5 阴性对照处理：取阴性对照 100 µL，加入 200 µL 消化液和 20 µL 蛋白酶 K，振荡混匀后，置 56 ℃
水浴中消化 1 小时。
操作步骤
1 病毒 DNA 的提取
1.1 从水浴锅中取出样品管，降至室温后，加入 300 μL DNA 结合液，颠倒混匀，将全部液体移入吸 附柱中（吸附柱要套上收集管，吸取液体时尽量不要吸到悬浮杂质，以免离心时堵塞吸附柱），室温 静置 3 min，10000 rpm 离心 30 s。
1.2 弃去收集管中液体，加入 500 μL DNA 洗涤液，10000 rpm 离心 30 s。
1.3 重复步骤 1.2。
1.4 弃去收集管中液体，10000 rpm 空柱离心 1 min，以除去残留的 DNA 洗涤液。
1.5 将吸附柱放入新的 1.5 mL 离心管中，向柱中央加入 DNA 洗脱液（*好 56℃预热）50 μL，室温 放置 2 min，10000 rpm 离心 30 s，离心管中液体即为模板 DNA。
2 PCR 扩增
每份总体积 20 µL，含 16 µL PCR 反应液（用前混匀），2 µL Taq DNA 聚合酶，2 µL 模板 DNA。 例如：n 份样品，配制 n+1 份，16×（n+1）PCR 反应液，再加入 2×（n+1）Taq DNA 聚合酶，
混匀后取 18 µL 分装成 n 份，分别加入 2 µL 模板 DNA，加入 20 µL 矿物油覆盖（有热盖的 PCR 扩 增仪不用加），作好标记。
在 PCR 扩增仪上进行以下程序：95℃ 3min；循环 94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30S，共 35 次； 再 72 ℃延伸 10min。
3 电泳
称 3g 琼脂糖放于 500 mL 锥形瓶中，加入 50 倍稀释的 TAE 电泳缓冲液 200 mL（取 4 mL 50 倍 TAE 电泳缓冲液，用双蒸水稀释至 200 mL），于微波炉中熔解，再加入 10 µL 染色液混匀。在电泳 槽内放好梳子，倒入琼脂糖凝胶，待凝固后将 PCR 扩增产物 10 µL，点样于琼脂糖凝胶孔中，以 110～ 120 V 电压于 50 倍稀释的 TAE 电泳缓冲液中电泳，紫外灯下观察结果。
结果判定阳性对照出现 420bp 扩增带、阴性对照无带出现（引物带除外）时，实验结果成立。 被检样品出现 420bp 扩增带为 CPV 阳性，否则为阴性。
原创作者：福建盛嘉耐火材料有限公司
