摘要：在本应用简报中，我们展示了利用阴离子交换色谱法，在使用四种不同的高盐洗脱缓冲液（大浓度为 2 M）进行线性和阶梯梯度洗脱条件下，对四种蛋白质进行分离的相关信息。Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色谱系统的流路设计中未采用铁/钢质材料，因此可耐受生物分析和生物纯化应用中的严苛条件，从而保持其出色的 UHPLC 性能。使用四种盐（氯化钠 (2 M)、(1 M)、乙酸钠 (1 M) 和四甲基氯化铵 (1 M)）进行线性梯度洗脱时，均可获得保留时间和峰面积精确度。此外，使用 2 M 氯化钠作为洗脱缓冲液时，结果表明保留时间和分离度可保持稳定达 48 小时以上。在此类条件下，采用不锈钢材质的液相色谱系统会面临一些问题，例如盐引起的腐蚀，因此需要执行特殊的、繁杂的清洗步骤。使用 Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色谱系统则可以完全避免此类清洗步骤，从而提高生物分析或生物纯化应用的通量和效率。

言在诸如离子交换 (IEX) 或体积排阻色谱(SEC) 法中使用的高盐流动相，对于不锈钢材质的液相色谱系统而言是一项严峻挑战。由于长期使用含盐缓冲液所引发的腐蚀效应，导致此类液相色谱系统存在损坏的风险。其结果就是需要执行繁杂的清洗步骤。因此，强烈建议使用不含铁的系统，避免受到高盐浓度的影响。Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色谱系统在样品流路中不含金属成分。自动进样器、柱温箱和检测器流路中所有的毛细管和接头均完全是不含金属的，因此，生物分子只与陶瓷或 PEEK 管线接触。这使得用户可以使用高盐含量的缓冲液。此外，相对于 Agilent 1260 Infinity 液相色谱系统而言，该系统可在较宽的 pH 范围（1-13，短时间分析可以高达 14）内保持稳定1。在本应用简报中，以阴离子交换色谱 (AEX)为例，论证了将 Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色谱系统用于高盐应用的可行性。利用阴离子交换色谱 (AEX) 对四种蛋白质混合物进行分离，其中使用了四种不同的洗脱盐：氯化钠 (2 M NaCl)、 (1 M KCl)、乙酸钠 (1 M CH3COONa)和四甲基氯化铵 (1 M [(CH3)4N]Cl)。在线性和阶梯梯度条件下，分别分析了保留时间和峰面积的精确度。此外，还使用 2 MNaCl 洗脱缓冲液考察了保留时间和峰面积的长时间稳定性（48 小时）。

实验部分Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色谱系统，包括以下模块：• Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元泵(G5611A)• Agilent 1260 Infinity 高效生物惰性自动进样器 (G5667A)• Agilent 1260 Infinity DAD VL（G1315D，配置生物惰性标准流通池，10 mm）• Agilent 1290 Infinity 柱温箱 (G1316C)色谱柱Agilent Bio WAX，NP5，4.6 × 250 mm，PK 色谱柱软件Agilent OpenLAB CDS ChemStation，LC和 LC & MS 系统版，修订版 C.01.02 [14]溶剂缓冲液 A： 20 mM Tris，pH 7.6缓冲液 B： 20 mM Tris，pH 7.6 +• 2 M NaCl• 1 M KCl• 1 M CH3COONa• 1 M [(CH3)4N]Cl所有试剂均为液相色谱。新制超纯水产自配置 0.22 µm 膜式终端过滤器 (Millipak)的 Milli-Q Integral 水纯化系统。Tris 购自Fluka 公司（西格玛奥德里奇，美国圣路易斯）。NaCl 购自 VWR 公司（美国宾夕法尼亚州拉德诺）。[(CH3)4N]Cl 和 KCl 购自 Merck KGaA 公司（德国达姆斯塔特）。CH3COONa 购自 J.T. Baker 公司（VWR，美国宾夕法尼亚州拉德诺）。

柱塞杆密封垫清洗液• 100% 超纯水• 每 1.5 min 清洗 0.3 min蛋白质• 取自马骨骼肌的肌红蛋白，17053 Da，pI 6.9 (1 mg/mL)• 取自鸡蛋清的伴清蛋白，76000 Da，pI 6.24 及 6.092 (2 mg/mL)• 取自牛奶的 a-乳清蛋白，14175 Da，pI 4.5 (1 mg/mL)• 取自大豆的胰蛋白酶抑制剂，20100 Da，pI 4.5 (1 mg/mL)所有蛋白质均购自西格玛奥德里奇公司（美国圣路易斯）。

结果和讨论线性梯度阴离子交换色谱，使用 2 M NaCl利用 AEX 在线性梯度条件下，对四种蛋白质的混合物进行了分离，缓冲液 B 中使用 2 M NaCl 作为洗脱盐。图 1 中所示为线性梯度条件下蛋白质的分离色谱图。蛋白质的洗脱顺序主要与其等电点 (pI) 有关。其中 a-乳清蛋白及胰蛋白酶抑制剂的分离与蛋白表面的电荷变化有关，其未必与总净电荷相等。七次运行后测定其保留时间和峰面积相对标准偏差，即为精确度。伴清蛋白中存在不同的异构体，具体取决于其结合铁的量2。因此，选取五个色谱峰对保留时间精确度进行评估。相反的是，伴清蛋白色谱峰不能用于计算峰面积 RSD，原因在于其异构体未能实现基线分离。所有五个色谱峰的保留时间 RSD均小于 0.09 %。所评估蛋白质的峰面积RSD 均小于 1.1%。

阴离子交换色谱，使用不同类型的盐分离度和选择性受洗脱离子，即盐类型改变的影响3。根据所分析蛋白质的不同，盐可能会对蛋白质洗脱产生不同的色谱影响。为了找到针对具体应用的佳洗脱离子，可以对多种盐进行测试。如果在一个序列中需要测试多于三种盐类型，那么在方法开发过程中好选用溶剂选择阀。在本应用简报中，在洗脱缓冲液中评估了四种盐。图 2、3 和 4 中所示为线性梯度条件下蛋白质的分离结果，分别采用 1 M KCl（图 2）、1 M CH3COONa（图 3）和 1 M[(CH3)4N]Cl（图 4）作为洗脱盐。并计算了保留时间和峰面积的 RSD，其中 n = 7。

实验证实保留时间、分离度以及峰形和强度的变化与所使用的洗脱盐有关。特别是，伴清蛋白 A 和 B 的分离度在使用不同盐类型时也不同，其中使用 1 M CH3COONa时的分离度佳。考虑到上述所有因素（佳分离度、佳峰形和高强度），且使基线为平直，则 1 M KCl 是分离四种蛋白质的选择。

阶梯梯度使用阶梯梯度（特别是只有一种蛋白质需要分离时）可以加速分离过程，从而降低缓冲液的消耗量。图 5 和 6 中所示为阶梯梯度下的蛋白质分离，分别使用了 1 MKCl（图 5）和 1 M CH3COONa（图 6）。并计算了保留时间和峰面积的 RSD，其中n = 7。由于 AEX 色谱柱所需的平衡时间较长，与线性梯度相比，阶梯梯度的保留时间和峰面积精密度略差。此外，在梯度阶梯的时间点可观察到负峰，同样是由于平衡时间不足引起的。

为了证明在使用高盐缓冲液条件下保留时间和分离度的长期稳定性，以 2 M NaCl作为洗脱盐对蛋白质分离的情况（线性梯度）进行了长达 48 小时的监测，请参见图 7 和 8。结果证实在整个时间段内，保留时间和分离度均保持稳定。在所有测试中，柱塞杆密封垫清洗液（含有 100%水）每 1.5 分钟启用一次，清洗 0.3 分钟，以去除泵柱塞杆上的盐

结论本应用简报论证了 Agilent 1260 Infinity生物惰性四元液相色谱系统是高盐应用的理想选择。通过采用阴离子交换色谱法对四种不同蛋白质进行分离，使用四种不同的洗脱离子/盐类型在线性梯度条件下均可获得较高的精确度。根据所使用的盐类型，色谱图中的保留时间、分离度、峰形和强度随之变化。因此，我们建议测试不同的盐类型，找到适宜的一种以实现佳的样品分离。如果需要测试多于三种盐类型，那么在方法开发过程中好选用溶剂选择阀。当使用 2 M NaCl 作为蛋白质分析的洗脱盐时，结果证实保留时间和分离度可在超过 48 小时的时间内保持稳定。采用阶梯梯度可缩短分离时间，并降低缓冲液消耗。但是，需要考虑的是色谱柱需要更长的平衡时间。因此，强烈建议在每次分析之间留有足够的平衡时间，不论使用的是线性还是阶梯梯度。另外一个要点是定期（例如，每 1.5 分钟清洗 0.3 分钟）进行密封垫清洗（含有 100% 水），以去除泵柱塞杆上的盐。在高盐应用中，Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色谱系统和 Agilent BioWAX，NP5，4.6 x 250 mm，PK 色谱柱均表现出了保留时间和分离度稳定性

原创作者：上海斯迈欧分析仪器有限公司